丁利平， 韓 瑩， 成 祥， 趙 彤， 朱玲玲,3△， 廖 紅△

(1. 中國(guó)藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院， 南京 210009; 2. 軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所， 北京 100850; 3. 江蘇省神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心， 南京 210009)

高原環(huán)境由于缺氧可導(dǎo)致平原人進(jìn)入高原地區(qū)，不能適應(yīng)高原環(huán)境，發(fā)生高原地區(qū)的特有疾病，即急性高原病[1]。急性高原病嚴(yán)重時(shí)可進(jìn)一步發(fā)展成急性腦水腫，進(jìn)而威脅生命。近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示炎癥在加重高原低氧腦水腫和肺水腫中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)給予小鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理，隨后進(jìn)行高原低氧暴露，可導(dǎo)致小鼠發(fā)生腦水腫[2]。通常，急進(jìn)海拔 4 000 m以上地區(qū)高原腦水腫發(fā)生率明顯增加，在海拔4 000 m至5 000 m地區(qū)的發(fā)生率是0.5%～ 1.0%[3]。而據(jù)報(bào)道發(fā)生胃腸道或呼吸道感染后進(jìn)入高原地區(qū)的人群更易患急性高山病[4]。血腦屏障的破壞被認(rèn)為是引起腦水腫的重要因素。星形膠質(zhì)細(xì)胞的終足結(jié)構(gòu)是血腦屏障的組成成分。LPS是多數(shù)革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分，由類脂A,核心寡糖和O-抗原組成[5]。LPS可以刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞膜上的Toll樣受體，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[6]。然而，低氧調(diào)節(jié)腦炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制尚待闡明。

當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí)，通過(guò)上調(diào)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)的表達(dá)，對(duì)低氧做出適應(yīng)性反應(yīng)。BNIP3(Bcl-2/E1B-19K-interacting protein 3)屬于Bcl-2家族中BH3-only蛋白，主要位于線粒體外膜上，是低氧誘導(dǎo)因子-1ɑ(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)的靶基因之一。低氧時(shí)，HIF-1α誘導(dǎo)BNIP3的表達(dá)。BNIP3參與許多疾病的病理過(guò)程，如癌癥和缺血性疾病[7]。低氧能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展[8]。但是，目前關(guān)于BNIP3在星型膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的表達(dá)和作用的研究還未見報(bào)道。本研究利用體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察在低氧聯(lián)合LPS刺激時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3和炎性因子的表達(dá)規(guī)律。旨在為高原腦損傷的病理機(jī)制提供一些新的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，胰酶(Hyclone公司)，胎牛血清(Ausbian公司)，BNIP3抗體(Abcam公司)，Hif-1α抗體(Gentex公司)，β-actin抗體和LPS (Sigma公司),小鼠ELISA炎癥細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(欣博盛公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)，SYBR Green試劑(Roche公司)，ECL發(fā)光液(Bio-Rad公司)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(Roche公司)。

1.2 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

用75%乙醇消毒出生24 h內(nèi)的C57乳鼠(由斯貝福公司提供)，斷頭，分離腦組織，在顯微鏡下去除腦膜和血管，分離出皮層，剪碎至約1 mm大小，加入0.25%胰酶消化，用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化，離心，棄上清，重懸，濾網(wǎng)過(guò)濾后，接種到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換液。以后每隔 3 d 換 1 次液，培養(yǎng)7 d，觀察到大多數(shù)的細(xì)胞融合成片，細(xì)胞折光性較差。將培養(yǎng)瓶置于搖床上，180 r/min，12 h，除去小膠質(zhì)細(xì)胞。0.25%胰酶消化，離心，重懸，接種，將細(xì)胞分組，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 原代神經(jīng)元的培養(yǎng)

取孕期 18 d C57小鼠(由斯貝福公司提供)，麻醉后，打開腹腔，分離胚胎置于分離解剖液中。分離皮層，加入0.25%胰酶消化。用10%含胎牛血清的DMEM /F12培養(yǎng)基終止消化，計(jì)數(shù)，按 1×106cells/cm2細(xì)胞接種到多聚賴氨酸預(yù)先包被的培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換 Neurobasal /B27 培養(yǎng)基，每隔3 d 換1/2液。培養(yǎng)7 d后，觀察細(xì)胞形態(tài)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為：常氧組，LPS組，低氧組和LPS+低氧組。LPS處理后，低氧組和LPS+低氧組放入低壓低氧細(xì)胞孵箱， LPS組和常氧組放入正常的細(xì)胞孵箱。LPS濃度：100 ng/ml，氧氣濃度為0.3%。處理時(shí)間如表2、3、4和5注釋所示。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.5 Western blot法檢測(cè)原代神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞BNIP3蛋白表達(dá)

用PBS漂洗細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解，離心2 700 r/min,4 min，提取總蛋白質(zhì)。用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE電泳分離蛋白。120 V，90 min將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。裁剪目的蛋白所在的條帶。將目的條帶和相應(yīng)的一抗放在抗體盒中，4℃孵育過(guò)夜。使用的抗體有抗BNIP3 抗體(1∶1 000)，抗HIF-1α抗體(1∶1 000)和抗β-actin 抗體 (1∶10 000)。過(guò)夜孵育后，用TBST洗滌3次，每次10 min。用相應(yīng)的二抗(1∶10 000) 室溫孵育1 h。用TBST洗滌3次，每次10 min。ECL 法進(jìn)行顯色,β-actin作為內(nèi)參蛋白。

1.6 RT-PCR檢測(cè)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)

收集上述各組處理后的細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，其OD260/280在1.8～2.2。根據(jù)TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。TNF-α，IL-1β和IL-6的引物序列(由上海生工生物工程公司合成)見表1。RT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃15 s、56℃ 20 s、72℃ 30 s共循環(huán)39次。以β-actin為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCT法計(jì)算TNF-α，IL-1β和IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

Tab. 1 Gene primer sequences of TNF-α, IL-1β, IL-6 and β-actin

1.7 ELISA檢測(cè)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA分泌變化

收集上述各組細(xì)胞上清液，用ELISA法檢測(cè)上清中TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的水平。具體方法參照試劑盒操作說(shuō)明。使用酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧或聯(lián)合LPS處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子表達(dá)的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，LPS刺激對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)均影響顯著(P<0.01)；低氧處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子TNF-α的表達(dá)影響不顯著(P>0.05)，對(duì)IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)影響顯著(P<0.01)。在對(duì)IL-1β和IL-6mRNA的表達(dá)方面，LPS刺激和低氧處理兩個(gè)因素交互作用明顯(P<0.05，P<0.01)。組間兩兩分析結(jié)果如表2所示：與常氧組比較，LPS組和LPS+低氧組的炎癥因子TNF-ɑ、IL-1β和IL-6 mRNA水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與LPS組比較，LPS+低氧組炎癥因子IL-1β和IL-6 mRNA水平進(jìn)一步升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果表明低氧能夠增強(qiáng)LPS刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

Tab. 2 The expressions of TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA in primary astrocytes n=3)

2.2 低氧或聯(lián)合LPS對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥因子分泌的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，LPS刺激對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子TNF-α，和IL-6的分泌變化影響顯著(P<0.01)；對(duì)IL-1β的分泌變化影響不顯著(P>0.05)低氧處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的分泌變化影響均不顯著(P>0.05)。在對(duì)TNF-α，IL-1β和IL-6分泌變化方面，LPS刺激和低氧處理兩個(gè)因素交互作用不明顯(P>0.05)。組間兩兩比較結(jié)果如表3所示：在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，與常氧組比較，LPS組和LPS+低氧組的炎癥因子TNF-α和IL-6分泌水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IL-1β分泌沒(méi)有變化，低氧組TNF-α，IL-1β和IL-6分泌水平均沒(méi)有變化，與LPS組比較，LPS+低氧組炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6分泌水平均沒(méi)有明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示LPS刺激能使星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-6增加，但LPS和低氧聯(lián)合作用未能使其增加更明顯。

Tab. 3 The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 inthe medium of primary cultured astrocytes (pg/ml, n=3)

2.3 低氧或聯(lián)合LPS對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3表達(dá)的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，LPS刺激對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中BNIP3的表達(dá)影響不顯著(P> 0.05)。低氧處理對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中BNIP3的表達(dá)均影響顯著(P<0.01)；兩個(gè)因素間的交互作用不明顯(P>0.05)。組間兩兩比較結(jié)果如表4所示：在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，與常氧組比較，LPS組BNIP3的表達(dá)沒(méi)有變化，低氧組和LPS+低氧組BNIP3的表達(dá)明顯增加(P<0.01)；在神經(jīng)元中，與常氧組比較，LPS組BNIP3的表達(dá)沒(méi)有變化，低氧組和LPS+低氧組BNIP3的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與神經(jīng)元的低氧組比較，星形膠質(zhì)細(xì)胞的低氧組BNIP3的表達(dá)顯著增加(P<0.01，圖1，表4)。結(jié)果說(shuō)明星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3對(duì)低氧反應(yīng)更敏感。

Fig. 1 Expressions of BNIP3 in primary astrocytes and neurons

Tab. 4 Relative expression of BNIP3 in primary astrocytes and neurons n=3)

2.4 低氧或聯(lián)合LPS對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3表達(dá)的影響

雙因素方差分析結(jié)果顯示，LPS刺激對(duì)6 h和12 h時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)影響顯著(P<0.01)，對(duì)24 h時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)影響不顯著(P>0.05)；低氧處理對(duì)3個(gè)時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)影響均顯著(P<0.01)；兩個(gè)因素對(duì)6 h和12 h時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)影響的交互作用明顯(P< 0.01)，對(duì)24 h時(shí)間點(diǎn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)交互作用不明顯(P>0.05)。組間兩兩比較結(jié)果如表5所示：在相同時(shí)間點(diǎn)，與常氧組比較，LPS組BNIP3的表達(dá)沒(méi)有變化，低氧組和LPS+低氧組BNIP3的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；與低氧組比較，6 h和12 h時(shí)間點(diǎn)LPS+低氧組BNIP3的表達(dá)顯著增加(P<0.01，圖2，表5)。上述結(jié)果說(shuō)明炎癥能促進(jìn)低氧條件下原代星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)，提示BNIP3在星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)中可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。

Fig. 2 Dynamic change of BNIP3 expression in primary astrocytes

3 討論

目前關(guān)于高原腦水腫的具體病理機(jī)制尚待闡明。研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射 LPS聯(lián)合高原低氧暴露能夠加重腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞的損傷，加重腦水腫的發(fā)生和發(fā)展[2]。據(jù)報(bào)道腦組織缺血缺氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞被活化[9]。大鼠進(jìn)行低氧暴露(8 000 m,8 h)后，星形膠質(zhì)足突出現(xiàn)腫脹，腦組織出現(xiàn)水腫[10]。上述研究表明星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦水腫的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。當(dāng)下關(guān)于低氧下星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制并不清楚。白瑜珊等研究發(fā)現(xiàn)低氧增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中脂多糖誘導(dǎo)的IL-1β表達(dá)[11]。Gessi S等發(fā)現(xiàn)LPS刺激聯(lián)合低氧(1%)作用后，星形膠質(zhì)細(xì)胞中HIF-1α的蛋白表達(dá)增加，其下游的基因iNOS和AB2受體在復(fù)合作用下增加明顯[12]。與本文的研究結(jié)果相符，LPS和低氧聯(lián)合作用使星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)明顯增加。當(dāng)機(jī)體處于低氧環(huán)境時(shí)，低氧誘導(dǎo)因子-1(hif-1)的降解被抑制，hif-1與BNIP3啟動(dòng)子上的低氧反應(yīng)原件(hypoxic responsive element，HRE)結(jié)合，激活BNIP3的轉(zhuǎn)錄。BNIP3作為Bcl-2家族的一員，主要包含以下幾個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：(1)PEST結(jié)構(gòu)域，參與BNIP3的降解；(2)BH3結(jié)構(gòu)域，參與BNIP3介導(dǎo)的caspase凋亡途徑和自噬；(3)跨膜結(jié)構(gòu)域和羧基端結(jié)構(gòu)域，跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)τ贐NIP3定位至線粒體外膜和發(fā)揮促凋亡作用是必不可少的，跨膜結(jié)構(gòu)域的缺失不能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[13]。BNIP3 有著雙重作用，既可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡或壞死，也可以介導(dǎo)線粒體自噬，促進(jìn)細(xì)胞存活。

Tab. 5 Relative expression of BNIP3 in primary astrocytes at different time n=3)

目前關(guān)于低氧下星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)的研究報(bào)道較少。TorronterasR等研究發(fā)現(xiàn)在1%O2處理6 h后，人的星形膠質(zhì)細(xì)胞中HIF-1ɑ穩(wěn)定表達(dá)，從而其下游靶基因BNIP3表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞存活和發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，但具體的作用機(jī)制不明[14]。而何芳等實(shí)驗(yàn)表明在氧糖剝奪/復(fù)氧模型中，膠質(zhì)細(xì)胞系C6細(xì)胞的BNIP3表達(dá)增加，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究通過(guò)體外原代培養(yǎng)神經(jīng)元和星型膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BNIP3在這兩種細(xì)胞中都有表達(dá)，且低氧后細(xì)胞中BNIP3表達(dá)均增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。黃廣海等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在腦缺血3 h和9 h時(shí)，BNIP3表達(dá)升高，線粒體自噬被激活，隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)至24 h，BNIP3表達(dá)降低，線粒體自噬被抑制，腦梗死體積增大，說(shuō)明在腦缺血早期，BNIP3可能通過(guò)線粒體自噬起到保護(hù)作用[16]。BNIP3可以通caspase凋亡途徑，線粒體膜電位的丟失，線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔的開放，細(xì)胞色素C的釋放等方式介導(dǎo)細(xì)胞死亡[13]。線粒體自噬是指以自噬的方式清除細(xì)胞內(nèi)損傷的或不需要的線粒體，維持線粒體的動(dòng)態(tài)平衡。借助結(jié)構(gòu)中LC3 相互作用結(jié)構(gòu)域(LC3-interaction region，LIR)，BNIP3與自噬體外膜上的微管相關(guān)蛋白 1-輕鏈 3(microtubule- associated protein1 light chain 3，LC3)結(jié)合，組成線粒體和自噬體的復(fù)合物，再與溶酶體結(jié)合，線粒體被降解[17]。BNIP3也可以與 Bcl-2 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，釋放出Beclin-1，引起線粒體自噬。 Hong等研究發(fā)現(xiàn)黃體酮通過(guò)提高星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬水平抑制Aβ誘導(dǎo)的炎癥[18]。而Periyasamy P等研究表明可卡因通過(guò)誘導(dǎo)自噬，激活人星形膠質(zhì)細(xì)胞[19]。LPS刺激(1 μg/ml)24 h也能引起星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度自噬，介導(dǎo)細(xì)胞死亡[20]。上述結(jié)果提示在缺血缺氧或氧糖剝奪模型中， BNIP3表達(dá)的升高可以直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可以激活自噬，介導(dǎo)細(xì)胞存活或死亡作用。而在不同的處理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞的自噬對(duì)細(xì)胞的作用也不盡相同。該研究發(fā)現(xiàn)低氧后BNIP3的表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞中增加更加明顯；LPS聯(lián)合低氧刺激后星形膠質(zhì)細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)較單純低氧組明顯增加。該結(jié)果提示BNIP3在星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)中可能具有一定的調(diào)節(jié)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)LPS刺激聯(lián)合低氧作用較單一處理使星形膠質(zhì)細(xì)胞的BNIP3表達(dá)進(jìn)一步增加，說(shuō)明LPS可能參與調(diào)控低氧下BNIP3的表達(dá)。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低氧聯(lián)合LPS刺激聯(lián)合低氧增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。該結(jié)果表明BNIP3可能參與星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控。接下來(lái)我們將研究BNIP3的表達(dá)變化對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的作用及其可能機(jī)制。通過(guò)敲低或過(guò)表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的BNIP3，觀察在低氧聯(lián)合LPS刺激條件下星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，存活和線粒體自噬變化，發(fā)現(xiàn)BNIP3調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)可能的機(jī)制,為星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，提供一些新的認(rèn)識(shí)。