張慧娟，王 強(qiáng)，姚 放

瘢痕疙瘩是皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)尤其是膠原過(guò)度沉積導(dǎo)致的結(jié)果，又被稱為結(jié)締組織增生癥。目前，臨床瘢痕疙瘩治療方法包括局部藥物注射、手術(shù)切除、免疫調(diào)節(jié)藥物治療等多種方法，但治療效果不佳，不能遏制其復(fù)發(fā)[1]。因此，探究瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制并尋找新的治療方法尤為重要。異甘草素是甘草中的異黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種功效[2]。但目前，異甘草素能否影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（keloid fibroblasts，KF）膠原的合成還未知。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子單鏈非編碼RNA，其通過(guò)與靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'untranslated region，3'UTR）特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯，負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)，在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3-5]。研究顯示，miR-181a在人瘢痕組織和KF細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)miR-181a表達(dá)可抑制KF細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是瘢痕疙瘩的潛在治療靶標(biāo)[6]。miR-181a-5p是miR-181a的成熟體，其對(duì)KF細(xì)胞膠原合成的影響還未知。Targetscan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，母親DPP同源物7（mothers against decapentaplegic homolog 7，Smad7）可能是miR-181a-5p的靶基因。研究表明，上調(diào)Smad7表達(dá)可抑制KF細(xì)胞中Ⅰ型（Col-Ⅰ）和Ⅲ型（Col-Ⅲ）膠原的合成[7]。本研究旨在探討異甘草素對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原合成的影響，并以miR-181a-5p/Smad7軸為切入點(diǎn)，探討異甘草素影響KF細(xì)胞膠原合成的分子機(jī)制，以期為瘢痕疙瘩的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

組織來(lái)源于2017年12月—2018年4月沈陽(yáng)市第七人民醫(yī)院收治的瘢痕疙瘩患者，共10例，其中男4例，女6例，平均年齡（27.69±6.83）歲。患者局部無(wú)破潰和感染，無(wú)任何治療史。經(jīng)患者同意，自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑

異甘草素（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，浙江天杭生物科技股份有限公司），DMEM培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），RNA抽提試劑盒和LipofectamineTM2000試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司），PCR引物（上海生工生物工程有限公司），鼠抗人 Col-Ⅰ和Col-Ⅲ抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），兔抗人Smad7抗體（美國(guó)Abcam公司），miR-181a-5p模擬物及模擬陰性序列、miR-181a-5p抑制劑及抑制劑陰性序列、Smad7小干擾RNA及亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）和熒光素酶載體（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒和雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[8]方法分離和培養(yǎng)KF細(xì)胞。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗瘢痕疙瘩組織3次，手術(shù)剪剪碎，0.2%Ⅰ型膠原酶溶液37℃消化3 h。含10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，過(guò)200目篩網(wǎng)。將濾液收集到15 ml離心管，1 500 r/min離心5 min，棄上清。用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5 %、濕度97 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1周后，更換新鮮培養(yǎng)基，以后每2～3 d更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80 %～90 %時(shí)，PBS清洗細(xì)胞，加入0.25 %胰蛋白酶溶液消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Smad7蛋白表達(dá) KF細(xì)胞以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，分為對(duì)照組（NC組）和異甘草素組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)。異甘草素組細(xì)胞分別用含20、40、80 μmol/L異甘草素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，0.25 %胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。PBS清洗細(xì)胞后，RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行定量。取一定量蛋白溶液，100℃煮沸5 min使其變性，然后以每泳道30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯二氟膜，于5%脫脂奶粉中封閉1 h。然后分別置于Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Smad7抗體孵育液中，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后，置于辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育液中，37℃孵育2 h。TBST洗膜后，滴加ELC顯影液，避光顯影后凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，Image J軟件分析Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)miR-181a-5p和Smad7 mRNA表達(dá)水平 NC組和異甘草素組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。PBS清洗后，參照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 40個(gè)循 環(huán)。miR-181a-5p上 游5'-CAAATTATTGTGGGT TGTC-3'，下 游 5'-TTATGGGTAGATGGGTGA-3'；Smad7 上 游5'-AGAGAAGGGACAAGGGGAAA-3'，下 游 5'-GCGGTGATTGCCTTGATATT-3'；U6上 游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游 5'-AACGC TTCACGAATTTGCGT-3'；GAPDH上游5'-CGGAGT CAACGGATTTGGTAT-3'，下游5'-AGCCTTCTCCAT GGTGGTGAAGA C-3'。miR-181a-5p以U6為內(nèi)參，Smad7以GAPDH為內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算miR-181a-5p和Smad7 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組培養(yǎng) KF細(xì)胞以每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合至60%時(shí)，更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別將miR-181a-5p抑制劑（antimiR-181a-5p組）、抑制劑陰性對(duì)照（anti-miR-con組）、miR-181a-5p 模擬物（miR-181a-5p組）、模擬物對(duì)照序列（miR-con組）、Smad7過(guò)表達(dá)載體（si-Smad7組）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-con組）轉(zhuǎn)染至KF細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后收集細(xì)胞。

收集的各組細(xì)胞以每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中。其中miR-con組和miR-181a-5p組細(xì)胞用含80 μmol/L異甘草素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，并分別記為異甘草素+miR-con組和異甘草素+miR-181a-5p組，其他各組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Smad7蛋白表達(dá)，方法與1.3.2、1.3.3相同。

1.3.5 miR-181a-5p與Smad7靶向關(guān)系驗(yàn)證 使用PCR技術(shù)擴(kuò)增含miR-181a-5p結(jié)合位點(diǎn)的Smad7的3'UTR序列，經(jīng)XhoⅠ酶切后插入pGL3-Promoter載體中，構(gòu)建Smad7野生型質(zhì)粒（WT-Smad7）。并利用定點(diǎn)突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)突變后，經(jīng)Xho Ⅰ酶切后插入pGL3-Promoter載體，構(gòu)建Smad7突變型質(zhì)粒（MUT-Smad7）。培養(yǎng)KF細(xì)胞，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Smad7與miR-181a-5p mimics或 miR-con、MUT-Smad7與miR-181a-5p mimics或miR-con至KF細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，收集細(xì)胞。細(xì)胞裂解后，檢測(cè)各組熒光素酶活性，具體操作參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Smad7蛋白表達(dá)水平及miR-181a-5p表達(dá)水平均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 異甘草素對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)的影響

與NC組比較，不同濃度（20、40、80 μmol/L）的異甘草素作用于KF細(xì)胞后，細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）（圖1）。

圖1 異甘草素對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

2.2 異甘草素對(duì)KF細(xì)胞中miR-181a-5p和Smad7表達(dá)的影響

與NC組比較，80 μmol/L的異甘草素作用于KF細(xì)胞后，細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Smad7 的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 異甘草素對(duì)KF細(xì)胞中miR-181a-5p和Smad7表達(dá)的影響

2.3 下調(diào)miR-181a-5p對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

與NC組或anti-miR-con組比較，anti-miR-181a-5p組KF細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而NC組與anti-miR-con組miR-181a-5p表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明miR-181a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染成功，anti-miR-181a-5p組KF細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)下調(diào)。與NC組或antimiR-con組比較，anti-miR-181a-5p組KF細(xì)胞上清中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），而NC組與anti-miR-con組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖 3）。

圖3 下調(diào)miR-181a-5p對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

2.4 上調(diào)Smad7對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

與NC組或pcDNA-con組比 較，pcDNA-Smad7組 KF細(xì)胞中Smad7 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而NC組與pcDNA-con組Smad7mRNA表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明Smad7過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成功，pcDNA-Smad7組KF細(xì)胞中Smad7表達(dá)上調(diào)。與NC組或pcDNA-con組比較，pcDNA-Smad7組KF細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），而NC組與pcDNA-con組 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 上調(diào)Smad7對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

2.5 miR-181a-5p靶 向 調(diào) 控Smad7的表達(dá)

Targetscan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，Smad7的3'UTR與miR-181a-5p存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Smad7與miR-181a-5p mimics熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Smad7與miR-con的細(xì)胞（P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染MUT-Smad7與miR-181a-5p mimics的細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染MUT-Smad7和miR-con的KF細(xì)胞比較，后兩者的KF細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化（P＞0.05）（圖5B）。miR-181a-5p組miR-181a-5p水 平 高 于 miR-con組 [（2.16±0.19）∶（1.03±0.05），P＜ 0.05]，Smad7蛋白表達(dá)水平顯著低于miR-con組（P＜0.05），而antimiR-181a-5p組Smad7蛋白表達(dá)水平顯著高于antimiR-con組（P＜0.05）（圖5C）。

圖5 miR-181a-5p靶向調(diào)控Smad7的表達(dá)

2.6 上調(diào)miR-181a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)異甘草素對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

與異甘草素+miR-con組比較，異甘草素+miR-181a-5p組miR-181a-5p表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Smad7蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜ 0.05）（圖 6）。

圖6 上調(diào)miR-181a-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)異甘草素對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表達(dá)的影響

3 討論

異甘草素是甘草黃酮中的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理活性。研究顯示，異甘草素可通過(guò)抑制核因子（NF）-κB信號(hào)通路的活化有效降低人肺癌H460細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[9]；異甘草素可抑制低氧誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生，其作用機(jī)制與抑制活性氧族（ROS）的產(chǎn)生有關(guān)[10]。但目前，異甘草素對(duì)KF細(xì)胞膠原合成的影響還未知。本研究顯示，異甘草素作用于KF細(xì)胞后，細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示異甘草素可降低膠原沉積，具有開(kāi)發(fā)為治療瘢痕疙瘩藥物的潛在價(jià)值。

miRNA可調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生命過(guò)程，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究已表明，miR-194-3p[11]、miR-124-3p[12]和 miR-188-5p[13]多種miRNA參與調(diào)控KF細(xì)胞的增殖和膠原合成，是瘢痕疙瘩治療的潛在分子靶點(diǎn)。作為一種miRNA，miR-181a-5p參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。Liang等[14]研究顯示，miR-181a-5p的過(guò)表達(dá)可靶向抑制下調(diào)kruppel樣因子6的表達(dá)，從而抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖，且促進(jìn)其凋亡，可作為糖尿病腎病的治療靶標(biāo)。但miR-181a-5p對(duì)KF細(xì)胞膠原合成的影響還未知。本研究顯示，下調(diào)miR-181a-5p表達(dá)可降低KF細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原蛋白的表達(dá)；而異甘草素可降低KF細(xì)胞中miR-181a-5p表達(dá)，上調(diào)miR-181a-5p逆轉(zhuǎn)了異甘草素對(duì)KF細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原合成的抑制作用，提示異甘草素可能通過(guò)下調(diào)miR-181a-5p來(lái)抑制KF細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原合成。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）/Smad信號(hào)通路參與瘢痕疙瘩的形成。Smad蛋白是TGF-β/Smad信號(hào)通路中的信號(hào)中介分子，可將TGF-β與其受體結(jié)合后產(chǎn)生的信號(hào)從細(xì)胞質(zhì)傳導(dǎo)至細(xì)胞核中，進(jìn)而調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成。有報(bào)道稱，KF細(xì)胞中Smad7蛋白表達(dá)水平顯著低于正常皮膚成纖維細(xì)胞，上調(diào)Smad7表達(dá)可抑制KF細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原蛋白表達(dá)[15,16]，這與本研究結(jié)果一致。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因及檢測(cè)miR-181a-5p對(duì)KF細(xì)胞中Smad7蛋白表達(dá)的影響證實(shí)了miR-181a-5p靶向負(fù)調(diào)控Smad7表達(dá)。本研究還顯示，異甘草素可促進(jìn)KF細(xì)胞中Smad7表達(dá)，進(jìn)一步提示異甘草素可能通過(guò)下調(diào)miR-181a-5p進(jìn)而上調(diào)Smad7表達(dá)來(lái)抑制KF細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原的合成。

綜上所述，異甘草素可抑制KF細(xì)胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ膠原的合成，其機(jī)制可能與下調(diào)miR-181a-5p進(jìn)而上調(diào)Smad7表達(dá)有關(guān)。