潘曉芳 黃燕虹 黃浩然 李海明 陳建起 吳靜標(biāo)★

作者單位：1.廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所綜合檢驗四室，廣東，廣州510663

2.廣州市豐華生物工程有限公司，廣東，廣州510730

維生素D（vita min D，VD）是人體必需的一類脂溶性類固醇衍生物。體內(nèi)VD 經(jīng)兩次羥基化，形成具有生物活性的維生素代謝物（1，25?二羥基維生素D2，1，25?二羥基維生素D3等），其家族中最重要的成員就是25?羥基維生素D2（25?hydroxyvita min D2，25?OH VD2）和25?羥基維生素D3（25?hy?droxyvita min D3，25?OH VD3）［1］。《維生素D 及其類似物臨床應(yīng)用共識》指出：血清25?OH VD 水平檢測已被公認(rèn)為反映維生素D 狀態(tài)的最合理指標(biāo)［2］。LC?MS/MS 法能夠有效區(qū)分25?OH VD2 和25?OH VD3，比免疫法靈敏度更高，是臨床檢測維生素D 的金標(biāo)準(zhǔn)［2?3］。因此，本研究建立了同時準(zhǔn)確快捷測定血清中25?羥基維生素D2及25?羥基維生素D3的LC?MS/MS 法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

采用三重四極桿質(zhì)譜分析系統(tǒng)（FH?6000MD，廣州市豐華生物工程有限公司）；色譜柱（Accu?core aQ 2.1×50 mm，2.6 μm，Thermo Fisher Scientif?ic 公司）；多管漩渦混合儀（杭州奧盛儀器有限公司）；臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；氮氣發(fā)生器（Peak Scientific 公司）。

1.1.2 主要試劑

25?羥基維生素D 測定試劑盒（液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法）（廣州市豐華生物工程有限公司，批號：20190408）；甲醇：色譜純，含量≥99.9%（Thermo Fisher 公司）；實驗用水為Synergy 超純水，電阻率不低于18 MΩ·cm?1。

1.2 實驗參數(shù)

1.2.1 質(zhì)譜參數(shù)

色譜柱為Accucore aQ C18 色譜柱（2.1×50 mm，2.6 μm）；柱溫為40℃；流速為0.5 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；流動相A 為超純水（含0.1%甲酸），流動相B 為甲醇（含0.1%甲酸）。采用梯度洗脫：0.0～1.0 min 70%B，1.0～2.0 min 75%B，2.0～2.1 min 98%B，2.1～2.6 min 100%B，2.6～3.5 min 100%B，3.5～3.6 min 70%B，3.6～5.0 min 70%B。質(zhì)譜參數(shù)：離子源為電噴霧離子源（ESI）；離子模式為正極；噴霧電壓為3 500 V；離子傳輸管溫度為300℃；噴霧溫度為400℃；鞘氣流速為50；輔助氣流速為12；吹掃氣流速為0；Q1、Q3 分辨率（半峰寬）為0.7；質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）參數(shù)見表1。

1.2.2 液相色譜參數(shù)

柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A?超純水（含0.1%甲酸），B?純甲醇（含0.1%甲酸）。液相梯度見表2。

1.3 試液配制

1.3.1 同位素內(nèi)標(biāo)工作液的配制

取1.04 mg 25?OH VD2?d3 和1.05 mg 25?OH VD3?d3 標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解，分別配成1 000 μg/mL 的25?OH VD2?d3 和25?OH VD3?d3 同位素內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，再稀釋配制成2.5 μg/mL和5.0 μg/mL的25?OH VD2?d3和25?OH VD3?d3同位素內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.2 工作標(biāo)準(zhǔn)液的配制

取1.01 mg 25?OH VD2和1.01 mg 25?OH VD3標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解，分別配成1 000 μg/mL的25?OH VD2和25?OH VD3標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

將兩種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，以BSA 磷酸鹽緩沖水溶液為溶劑，采用逐級稀釋法，配成6 個25?OH VD2和25?OH VD3標(biāo)準(zhǔn)品混合液，得到1.99、3.98、9.95、19.90、39.80、99.50 ng/mL 的25?OH VD2工作標(biāo)準(zhǔn)溶液和4.98、10.95、29.85、59.70、104.48、248.75 ng/mL的25?OH VD3工作標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 25?OH VD 的待測樣本的制備

①取待測樣本200 μL 于相應(yīng)的2 mL 離心管中，加入200 μL 的25?OH VD 同位素內(nèi)標(biāo)工作液，旋渦45 秒。②加入1 000 μL 的25?OH VD 萃取液，在2 000～2 400 rpm 振頻下旋渦振蕩10 分鐘，于-20℃下靜置10 分鐘，13 000 rpm 離心5 分鐘。③取最上層液體800 μL 轉(zhuǎn)移到96 孔V 型底深孔板中，室溫下氮氣吹干。④加入200 μL 的25?OH VD 復(fù)溶液，蓋好硅膠墊封板，在2 000～2 400 rpm振頻下旋渦振蕩3 分鐘，進(jìn)行復(fù)溶，置于96 孔板離心機(jī)中3 000～3 500 rpm 離心5 分鐘。⑤放入自動進(jìn)樣器中，吸取上清液，進(jìn)行樣本檢測、分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0 對線性相關(guān)性、準(zhǔn)確度相對偏差、重復(fù)性變異系數(shù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 保留時間和色譜分離驗證

25?OH VD2、25?OH VD2?d3 和25?OH VD3、25?OH VD3?d3 對應(yīng)色譜圖見圖1 和圖2，分別在2.80、2.79 和2.76、2.76 min 出峰。

2.2 分析方法的線性關(guān)系驗證

測試系列25?OH VD2和25?OH VD3工作標(biāo)準(zhǔn)溶液，將結(jié)果平均值和理論值用最小二乘法進(jìn)行線性擬合，并計算線性相關(guān)系數(shù)（r），結(jié)果見圖3。

2.3 準(zhǔn)確度試驗結(jié)果

分別檢測25?OH VD2和25?OH VD3的高低兩個樣本，計算相對偏差，25?OH VD2高低兩個樣本的相對偏差分別為-5.62%～4.73%和-3.11%～1.48%，25?OH VD3高低兩個樣本的相對偏差分別為1.23%～7.91%和-4.09%～1.27%，見表3。

2.4 檢測限試驗結(jié)果

在H?ESI 正離子模式下，檢測經(jīng)過前處理濃度為2 ng/mL 的和25?OH VD2/D3時，最小信噪比SN為69，試驗結(jié)果見表4。

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果

用同一批試劑盒，以質(zhì)控品的低值和高值為樣本，每個測試樣本重復(fù)檢測10 次，計算變異系數(shù)，試驗結(jié)果顯示25?OH VD2/D3的變異系數(shù)CV 最大分別為3.67%和3.39%，見表5。

3 討論

VD 對人體健康至關(guān)重要，理論上與VD 相關(guān)或潛在疾病均需要VD 的檢測。維生素D 缺乏會引起骨骼系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、糖代謝、細(xì)胞增殖分化、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腫瘤等相關(guān)疾病。因此，定期檢測VD 水平對疾病預(yù)防有重要意義［2］。

25?OH VD 常用的檢測方法有液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法和免疫法（包括化學(xué)發(fā)光分析法、酶聯(lián)免疫法、克隆酶供體免疫測定法、免疫層析法、膠乳免疫比濁法）［4］。LC?MS/MS 法可以同時測定25?OH VD2和25?OH VD3，是臨床檢測25?OH VD 的“金標(biāo)準(zhǔn)”［2，3?6］。相對于免疫法，LC?MS/MS 法可以區(qū)分25?OH VD2和25?OH VD3，具有特異性強(qiáng)、靈敏度更高的特點，由于樣品中摻入了同位素標(biāo)記的25?OH VD2/D3，能夠很好地消除基質(zhì)效應(yīng)［7］。檢驗醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會（The Joint Committee for Traceabil?ity in Laboratory Medicine，JCTLM）認(rèn)可了NIST 和比利時根特大學(xué)建立的同位素LC?MS/MS 法定量測定血清中25?OH VD2、25?OH VD3的參考方法［8?10］。但是LC?MS/MS 法儀器昂貴，安裝條件嚴(yán)格，需要較大場地方可滿足要求；樣本前處理復(fù)雜，檢測通量比較低，比較難適應(yīng)臨床大批量樣本的需求；手工操作比較復(fù)雜，操作人員需要經(jīng)過比較專業(yè)的培訓(xùn)，難以推廣；盡管被公認(rèn)為檢測25?OH VD 的金標(biāo)準(zhǔn)，LC?MS/MS 法仍然易受3?epi?25OH?D3和3?epi?25OH?D2等異構(gòu)體的交叉影響，尤其對嬰幼兒的檢測易出現(xiàn)假陽性［11?13］。另外，由于色譜和質(zhì)譜條件等未標(biāo)準(zhǔn)化，不同實驗室之間的處理方法和色譜條件等不同，對同一個體也會產(chǎn)生不同的臨床評價。

廣州市豐華生物工程有限公司的25?羥基維生素D 測定試劑盒（液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法）采用液液萃取法，操作簡單快捷，樣本前處理步驟簡單、容易操作，沉淀蛋白和萃取一次完成，相比蛋白沉淀法基質(zhì)效應(yīng)更小，此方法簡便快速，實現(xiàn)了對25OH?D2和25OH?D3的分別定量，適用于臨床大樣本量檢測；其次試劑盒穩(wěn)定性很好，可以滿足2～8℃存放，隨取隨用；檢測25?OH VD2和25?OH VD3有良好的線性關(guān)系，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好的特點。25?OH VD 測定的其中一個問題是室間變異較大，各種免疫學(xué)方法之間的變異比較大，該試劑盒溯源至由美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）提供的SRM 968f，嚴(yán)格按照國家《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》進(jìn)行質(zhì)量管理體系建設(shè)，并獲得ISO 9001 及ISO 13485 認(rèn)證證書，試劑盒采用SRM 968f 驗證了方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果顯示25OH?D2和25OH?D3的準(zhǔn)確度均在100%左右。綜上，廣州市豐華生物工程有限公司的25?羥基維生素D 測定試劑盒（液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法）可以準(zhǔn)確反映VD2和VD3情況，適用于兒童、孕婦、成年人、老年人的VD 水平檢測，可以輔助臨床指導(dǎo)上述人群有效合理地補(bǔ)充維生素，做到早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)、早治療，對營養(yǎng)性疾病的降低有重大意義。

然而此次實驗尚有不足，然而此次實驗尚有不足，首先未通過比對或室間評價來驗證體系的臨床效果，其次是此方法仍然面臨25?OH VD 與結(jié)合蛋白徹底分離的問題。