由萬寧，賴永潔

現(xiàn)今心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）已成為全世界最主要的死亡原因［1］，其中瓣膜性心臟病（valve heart diseases，VHD）是CVD 的重要類型之一。隨著社會老齡化加劇，VHD 患病率逐年升高。據(jù)統(tǒng)計，美國75歲以上老年人中VHD的患病率為11.7%～13.3%［2］。我國成年人口中VHD的患病率為5.3%～7.7%［3］。VHD的兩大病理表現(xiàn)為瓣膜的纖維化與鈣化，而瓣膜內部細胞行為的改變是瓣膜發(fā)生病理改變的重要基礎［4-5］。瓣膜內部主要由瓣膜內皮細胞、瓣膜間質細胞（valve interstitial cells，VICs）和VICs 分泌的膠原蛋白、彈性纖維、蛋白多糖、纖連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）等多種細胞外基質（extracellular matrix，ECM）共同構成［6-7］。VICs 的數(shù)量約占瓣膜中細胞總數(shù)的80%，VICs與ECM對維持心臟瓣膜的正常結構與功能至關重要，VICs 具有向多種表型分化的潛能，其中肌成纖維細胞表型分化是瓣膜產(chǎn)生纖維化病理改變的關鍵環(huán)節(jié)，也是進一步促使瓣膜鈣化的因素之一，而成骨細胞表型分化則與瓣膜鈣化密切相關［8］。近年來對VICs分化的研究為揭示VHD的發(fā)生機制提供了重要的理論依據(jù)，現(xiàn)就有關VICs分化的最新研究進展作一綜述。

1 VICs的肌成纖維樣表型分化

正 常 VICs 表 現(xiàn) 為“ 靜 止 ”（quiescent VICs，qVICs）狀態(tài)，即成纖維細胞樣表型，但在損傷、某些細胞因子、異常血流或機械應力等刺激下會被激活轉變?yōu)榛罨╝ctivated VICs，aVICs）表型，即肌成纖維細胞樣表型［9］。aVICs 表現(xiàn)為細胞收縮性能增強以及細胞骨架成分，如α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）、結蛋白、波形蛋白等蛋白標志物以及基質分解代謝酶和彈性蛋白酶的表達增加。正常狀態(tài)下，aVICs在完成組織修復后將轉入靜止期恢復成為qVICs，或者發(fā)生凋亡以維持組織平衡穩(wěn)態(tài)［10］。相比qVICs，aVICs在ECM中產(chǎn)生膠原蛋白，特別是Ⅰ、Ⅲ型膠原的能力更強［11］。若VICs 的活化因素持續(xù)存在則可進一步導致瓣膜纖維化或鈣化的發(fā)生。

1.1 細胞因子的作用 目前研究普遍認為轉化生長因子-β1（TGF-β1）是主導qVICs活化的重要細胞因子之一，在炎癥或損傷等因素刺激下，遷移至瓣膜中的多種免疫細胞以及VICs 均可分泌TGF-β1，與細胞表面受體結合后通過經(jīng)典SMAD通路或絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）-p38 非經(jīng)典通路等促進qVICs 向 aVICs 表型轉變，表現(xiàn)為 α-SMA 表達增加，同時Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，結締組織生長因子等水平上調，促使瓣膜ECM 發(fā)生重構，從而引發(fā)瓣膜進一步的纖維化［12］或鈣化［13］。

Adesanya 等［14］研究發(fā)現(xiàn)細胞膜修復蛋白MG53（mitsugumin53）在VICs中有表達，MG53基因敲除小鼠更易于發(fā)生類似主動脈狹窄的病理改變，體外實驗證實，在VICs培養(yǎng)體系中加入MG53后，可顯著下調TGF-β1 所誘導的SMAD 同源物2（SMAD2）磷酸化水平，同時降低下游，如FN等靶基因的表達水平，對VICs 的活化過程產(chǎn)生有效抑制，推測MG53 可能通過參與VICs細胞膜修復，降低損傷對細胞產(chǎn)生的刺激，從而減少TGF-β1 信號通路的激活并抑制VICs 的活化。此研究雖未闡明具體的調控機制，但MG53 在VHD 進程中的保護作用為VHD 的治療提供了新的藥物靶點。

白細胞介素（IL）-18 為IL-1 超家族成員，是重要的炎性細胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)IL-18在主動脈鈣化患者血清以及鈣化瓣膜內部水平均顯著升高，體外實驗表明IL-18 通過激活核因子（nuclear factor，NF）-κB 通路上調高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein，HMGB1）水 平 進 而 促 進 VICs 活化［15-16］。但是，HMGB1如何參與調控VICs活化并不清楚，同時 VICs 是否分泌 IL-18，IL-18 促 VICs 活化與瓣膜鈣化之間的關聯(lián)也值得進一步探討。

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）-2被認為是健康瓣膜組織中維持VICs處于靜止狀態(tài)的關鍵細胞因子［17］。在瓣膜組織損傷修復過程中，F(xiàn)GF-2可抑制由TGF-β1所誘導的VICs活化，避免過量ECM 沉積，幫助及時終止修復，避免瘢痕產(chǎn)生，其與TGF-β1 之間的平衡對VICs 活化狀態(tài)以及瓣膜組織重構具有重要意義。此外，F(xiàn)GF-2 還可促使已活化的aVICs 發(fā)生去分化，恢復為靜止的qVICs，從瓣膜中分離得到的VICs 在體外培養(yǎng)時往往發(fā)生不同程度的自發(fā)活化，這對研究VICs的分化機制產(chǎn)生不利影響。若在VICs 原代培養(yǎng)體系中加入外源性的FGF-2，可將VICs 維持在低活化水平，則有助于相關細胞功能實驗的進行［18］。同時FGF-2對VICs 活化的抑制作用也為VHD 的干預與治療提供了新思路。

1.2 金屬蛋白酶的作用 去整合素樣金屬蛋白酶（a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motif，ADAMTS）家族是一類以多種ECM為降解底物的蛋白酶，通過ECM重構參與組織器官正常發(fā)育過程，同時其表達異常也與眾多疾病發(fā)生密切相關。近年來有關心血管疾病的研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS成員在瓣膜發(fā)育與疾病中的新作用［19］。ADAMTS-5 是重要的蛋白聚糖降解酶之一，在骨關節(jié)系統(tǒng)炎癥等疾病中?？梢娖渌缴仙６贏DAMTS-5基因敲除的動物模型中發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-5基因缺失可導致二葉主動脈瓣或二葉肺動脈瓣的先天發(fā)育異常［20］，提示了ADAMTS-5在維持瓣膜正常結構與功能中的作用。Li 等［21］研究發(fā)現(xiàn)ADAMTS-5 缺失促進了瓣膜鈣化的發(fā)生，體外細胞實驗則證實ADAMTS-5 缺失導致VICs 中matrilin2水平上調，matrillin2 是協(xié)助構建ECM 網(wǎng)絡重要的輔助蛋白，其水平升高促使與VICs 活化相關的蛋白表達水平上調，重組ADAMTS-5 蛋白處理VICs后matrilin2 蛋白水平下調并伴隨VICs 活化相關蛋白表達顯著下調，因此ADAMTS-5/matrilin2 軸參與了VICs 活化調控。針對兩者的靶向調節(jié)可能成為VHD 早期干預的策略之一。該項研究還發(fā)現(xiàn)，matrilin2 誘導 VICs 活化的同時，VICs 開始表達如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、runt相關轉錄因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）等成骨細胞分子標志物，提示VICs 活化與成骨細胞分化并非2 個孤立的分化路徑，但兩者的內在聯(lián)系還需進一步深入探討。

ADAMTS-19 是新近發(fā)現(xiàn)的ADAMTS 家族成員，其酶解底物不明，近期研究表明部分常染色體隱性遺傳心臟瓣膜病患者存在ADAMTS-19 基因功 能 的 缺 失 性 突 變［22-23］。 Wünnemann 等［22］對ADAMTS-19 基因敲除小鼠的研究證實，ADAMTS-19 功能缺失可導致瓣膜發(fā)育異常并出現(xiàn)進行性的主動脈瓣狹窄或反流；進一步分析表明，ADAMTS-19 是新型 VICs 標記分子，ADAMTS-19 基因敲除小鼠VICs 的活化相關蛋白α-SMA 水平下降，說明ADMTS-19 缺失抑制了VICs 活化。通過單細胞RNA 測序及轉錄組分析篩選出淋巴增強因子-1（lymphoid enhancer-binding factor 1，Lef1）參 與ADAMTS-19 的轉錄調控，Lef1 是 Wnt/β-catenin 信號通路的重要下游分子之一，隨后的VICs 體外培養(yǎng)實驗證實 ADAMTS-19 是 Wnt/β-catenin 通路的應答基因；但并不清楚此通路對ADAMTS-19 的調控是否參與了 VICs 活化。Chen 等［24］研究表明TGF-β1 可通過激活 β-catenin 誘導 VICs 活化，Wnt/β-catenin 通路與 TGF-β1 之間的協(xié)同效應可加強VICs 活化，據(jù)此推測Wnt 信號通路被抑制可能是ADAMTS-19 缺失導致VICs 活化減弱的機制之一，而進一步揭示該機制則需要對VICs 活化過程中Wnt/β-catenin 通路的激活水平進行深入研究。

1.3 力學因素作用 瓣膜對血流動力學以及機械應力的改變具有高敏感性，由VICs 活化所引發(fā)的ECM纖維化或鈣化可提高ECM硬度，進而上調VICs所承受的剪切應力，此過程可顯著誘導局部TGF-β1水平上調，進一步增強了VICs 的活化，參與VICs 應力感受的蛋白對其活化發(fā)揮重要作用［25］。Calponin2蛋白是一種肌動蛋白結合蛋白，能夠調節(jié)平滑肌收縮，參與細胞壓力信號傳導［26］。Plazyo等［27］發(fā)現(xiàn)Calponin2上調可增強VICs的活化指標α-SMA 的表達水平，Calponin2 可能通過與 α-SMA 的結合增強VICs 的收縮功能，促進VICs 的活化，提示Calponin2 上調與VICs 活化之間形成的正反饋通路可能是瓣膜進一步產(chǎn)生纖維化與鈣化的機制之一。

鈣黏蛋白（cadherin，CDH）家族是一類依賴鈣離子介導細胞間黏附的跨膜糖蛋白，其中CDH11是唯一可介導黏著斑形成的鈣黏蛋白，通過機械信號的傳遞參與細胞遷移、創(chuàng)傷愈合等生理過程，在瓣膜纖維化、鈣化等病變中均可見其水平顯著上調［28］。Wang 等［29］研究發(fā)現(xiàn) TGF-β1 處理可顯著上調VICs的 CDH11 表達水平，提示 CDH11 是 TGF-β1 的下游基因，將VICs 中的CDH11 基因敲低處理后α-SMA表達增加，VICs 活化水平提高；而增強CDH11 活性則顯著抑制VICs 活化，表明CDH11 在VICs 活化過程中可能發(fā)揮抑制作用，TGF-β1 在誘導VICs 活化時，不僅上調正向調控活化的靶基因，還促進負向調控活化靶基因的表達，這可能是細胞維持平衡穩(wěn)態(tài)的機制之一。Bowler 等［30］對 CDH11 基因敲除小鼠的分析證實，CDH11 缺失可上調α-SMA 水平，CDH11 對 VICs 活化存在負向調控，但 CDH11 亦可通過促進黏著斑形成以及上調IL-6通路增強VICs-ECM間的機械信號傳導，一定程度上對VICs活化起到促進作用，以上提示CDH11在VICs活化中的雙重功能，同時其在瓣膜疾病中的作用還需從多角度進行深入探討。

Ma等［31］利用人工合成水凝膠進行VICs的3D培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基基質硬度增加可顯著誘導VICs活化 ，此 時 VICs 中 Yes 相 關 蛋 白（Yes-associated protein，YAP）發(fā)生核轉位，YAP 作為轉錄協(xié)同因子可激活下游基因如α-SMA 表達。此研究中VICs 對周圍壓力上升的感知直接導致YAP 向核內轉移，而壓力下降則可見YAP 核內轉移被抑制。進一步分析發(fā)現(xiàn)，細胞黏著斑面積與YAP核轉移及VICs活化水平均呈正相關，證實黏著斑作為細胞與ECM間的連接點，是介導壓力信號傳導的關鍵結構。VICs 對壓力感應的調控成為VICs 活化機制又一值得關注的研究方向。

2 VICs的成骨表型分化

VICs 向成骨細胞表型分化可促進多種促鈣化因子上調，導致異位鈣化，在鈣化的早期階段，炎癥或者機械應力刺激VICs 可激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2 以及 Runx2 等與成骨細胞密切相關的重要信號分子，細胞開始表達ALP、骨鈣素等成骨細胞分子標志，VICs向成骨細胞表型分化，進一步導致瓣膜增厚變硬，最終發(fā)生鈣化［32］。

2.1 成骨分化相關信號通路

2.1.1 Wnt 通路 Wnt 信號通路廣泛參與人體生長發(fā)育和病理過程，是VICs成骨表型分化的重要調控因子［33］。Li 等［34］利用成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng) VICs 時發(fā)現(xiàn)細胞成骨標志物Runx2 表達增加，同時糖原合酶激酶（glycogen synthase kinase，GSK）-3β 與 βcatenin 表達水平明顯上調，而在培養(yǎng)體系中加入Ⅰ類組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑 MS-275 后，Runx2、GSK-3β 與 β-catenin 水平均顯著下降，且細胞內鈣質沉積明顯減少，表明Wnt/GSK-3β 和 Wnt/β-catenin 兩條通路被抑制可下調Runx2 的表達，進而抑制VICs 的成骨分化。Polley等［35］發(fā)現(xiàn)使用成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)VICs后，細胞中內源性無孢蛋白（asporin）表達水平降低，而將asporin重組蛋白加入培養(yǎng)體系后顯示成骨細胞分子標志骨橋蛋白和Runx2表達均減少，同時β-catenin、Wnt3a 水平下調，而Wnt3a 重組蛋白處理VICs 后細胞的成骨分子標志表達增加，在此基礎上再加入asporin 重組蛋白，細胞的成骨分化則被顯著抑制。因此，asporin作為瓣膜中的ECM成分可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活阻止VICs向成骨分化，證實Wnt通路激活對成骨分化的促進作用。以上研究未就相關蛋白如何抑制Wnt通路激活進行深入探討，但仍充分說明Wnt通路在驅動VICs 成骨分化中的關鍵作用，對此通路的研究對充分闡明VICs成骨分化機制十分重要。

2.1.2 MAPK/ERK 通路 細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）為MAPK激活后的下游信號分子之一，在細胞生長分化調控中具有重要作用。 蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）為絲氨酸蘇氨酸磷酸化酶，參與調控真核細胞內多種信號通路，在主動脈瓣膜鈣化模型小鼠以及成骨誘導培養(yǎng)的VICs中PP2A水平及活性顯著下降，VICs 中過表達PP2A 可見MAPK/ERK 通路被抑制，細胞成骨分化水平降低，而敲低PP2A后MAPK/ERK通路激活，細胞成骨分化水平升高，再次證實MAPK/ERK通路可能參與促進VICs成骨表型分化［36］。最近一項有關主動脈瓣膜鈣化疾病（aortic valve calcification disease，CAVD）的研究［37］發(fā)現(xiàn)，CAVD 患者血清中鋅離子水平較正常人明顯降低，體外細胞實驗表明在磷酸鹽誘導的VICs成骨分化模型中添加硫酸鋅可降低成骨相關基因的表達，并且還可通過抑制VICs 凋亡阻礙VICs 成骨分化。胞外鋅離子可通過結合胞膜上鋅敏感受體G蛋白偶聯(lián)受體39（G protein-coupled receptors，GPR39）激活MAPK/ERK 通路，抑制VICs 凋亡和成骨分化，研究者認為通過補充鋅離子可對CAVD 起到保護作用，但此研究還發(fā)現(xiàn)MAPK/ERK 對VICs 成骨分化發(fā)揮抑制作用。關于MAPK/ERK 信號通路在VICs 成骨分化中的作用，上述兩項研究的結果并不一致，這可能是不同研究中使用的成骨誘導分化培養(yǎng)基的成分不一導致細胞外環(huán)境存在差異，或是細胞種屬來源不同等因素導致。

2.1.3 Notch通路 Notch1是Notch細胞表面受體家族成員之一，通過與相應配體結合激活下游通路，在胚胎早期發(fā)育、細胞分化等方面具有重要生物學作用。近年研究發(fā)現(xiàn)其參與了VICs成骨分化進程，但其具體作用仍存在爭議。Majumdar 等［38］發(fā)現(xiàn)一氧化氮可通過上調泛素特異性蛋白酶9X（X-linked ubiquitin-specific protease 9，USP9X）的巰基-亞硝基化水平促進后者對下游Notch1 通路的激活作用，以此抑制主動脈瓣VICs的成骨分化過程，此研究認為激活Notch 通路對VICs 成骨分化有抑制作用，對此通路的調控機制研究可為CAVD的治療提供新的理論參考。Zeng等［39］研究結果顯示CAVD患者瓣膜鈣化區(qū)域中Notch1表達陽性的VICs數(shù)量較多，脂多糖處理VICs 后成骨分化指標明顯上升，Notch 通路被激活，Notch1表達量增加，而將Notch通路抑制后，脂多糖誘導VICs 成骨分化的水平則明顯減弱。此研究認為，Notch1 還參與激活 ERK1/2 與 NF-κB 兩條信號途徑以此促進VICs 成骨分化，表明除Notch 通路本身被激活之外，與其他信號通路之間的交互作用也是促進VICs 成骨分化的機制之一。此外，Perpelina 等［40］研究也認為 Notch1 通路激活可驅動VICs的成骨分化。與MAPK/ERK 通路類似，不同的研究對Notch通路在VICs成骨分化中的作用也存在不同看法，鑒于VICs 分化與周圍環(huán)境的密切關系，如能建立最大程度還原人體內微環(huán)境的VICs 體外培養(yǎng)體系可能是解決上述爭議的方法之一。

2.2 微小RNAs（miRNAs）與表觀遺傳調控 miRNA是一類可在轉錄水平上對靶基因進行調控的新型調控因子，目前利用miRNA譜技術對鈣化與非鈣化瓣膜的miRNA差異譜進行分析，已篩選出多種可能參與VICs 成骨分化調控的miRNA。miR-29b 在鈣化瓣膜中表達增加，降低其水平可減弱VICs的成骨分化。TGF-β3是miR-29b的直接靶標，miR-29b抑制TGF-β3 的同時 Wnt3/β-catenin 與 Runx2/Smad3 通路被激活繼而導致VICs 成骨分化，但TGF-β3 下調與促成骨分化信號通路激活之間的內在聯(lián)系仍需進一步研究［41］。miR-138 水平在鈣化瓣膜中顯著降低，將其模擬物作用于VICs中后，Runx2和ALP顯著下調，而將miR-138 抑制劑轉染細胞則增加Runx2與ALP 表達水平。miR-138 對VICs 成骨分化可能發(fā)揮抑制作用，通過靶點預測以及RNA和蛋白水平實驗證實轉錄因子叉頭框蛋白C1（forkhead box protein C1，F(xiàn)OXC1）是miR-138 的靶點，F(xiàn)OXC1 過表達促進VICs 成骨分化，敲低FOXC1 則抑制成骨分化，說明miR-138通過下調FOXC1抑制VICs成骨分化，但此過程中FOXC1通過哪些下游蛋白來發(fā)揮其促成骨作用尚不清楚［42］。Toshima 等［43］認為 miR-34a水平在鈣化瓣膜中上調，miR-34a通過下調靶基因Notch1 并抑制后者下游通路激活來促進VICs 成骨分化。另一組研究發(fā)現(xiàn)，miR-204 在鈣化瓣膜中表達極低，采用類似物上調VICs 中miR-204水平可降低 ALP 與 Runx2 的表達，而抑制 miR-204 則促進成骨標志物的表達，表明miR-204 的存在可負向調控VICs 成骨分化［44］，但此研究并未確定其靶基因，對其調控機制的解釋仍需補充。miRNAs在VICs成骨分化中的功能因其靶點差異而有所不同，揭示靶基因與成骨分化通路之間的關聯(lián)機制有助于全面準確認識miRNAs的作用，為進一步防治CAVD提供新的線索。

此外，長鏈非編碼RNA（lncRNA）也參與VICs分化調控，肺腺癌轉移相關轉錄子1（metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1，MALAT1）是一種在心血管系統(tǒng)中高表達的lncRNA，參與多種心血管疾病發(fā)生［45］。MALAT1在鈣化瓣膜以及VICs成骨分化模型中表達水平升高，體內實驗證明MALAT1通過與miR-204的吸附作用抑制后者活性；Smad4 為 miR-204 的靶基因，Smad4 被抑制則阻礙VICs的成骨分化，MALAT1通過負向調控miR-204 來促進Smad4 所介導的成骨分化，MALAT1、miR-204及其靶基因Smad4之間構成的縱向調節(jié)軸可能是調控VICs 成骨分化的機制之一［46］。肌動蛋白纖維相關蛋白1-反義RNA 1（actin filamentassociated protein 1-antisense RNA 1，AFAP1-AS1）是另一種在鈣化瓣膜中存在高表達的lncRNA，它通過調節(jié)miR-155/Smad5 軸，增加Smad5 的表達來促進VICs向成骨表型分化［47］。此外，OPA相互作用蛋白5-反義RNA 1（OPA interacting protein 5-antisense RNA 1，OIP5-AS1）作為 lncRNA，與 miR-137 的結合可導致下游蛋白Twist1 水平升高，從而阻礙VICs成骨分化［48］。由此可見，lncRNAs通過類似“分子海綿”的作用吸附miRNAs 后解除后者對其下游靶基因的抑制作用，增強靶基因的表達水平，而靶基因的具體功能將決定lncRNA 作為上游調控分子對VICs成骨分化產(chǎn)生何種影響。lncRNA、miRNA及其下游靶基因三者之間的調控機制為VICs 成骨分化、CAVD的防治開辟了一個新的研究方向。

DNA 甲基化能夠通過抑制相應基因轉錄實現(xiàn)對基因的表達調控，是一種重要的表觀遺傳調控方式［49］。Zhou 等［50］在鈣化瓣膜與 VICs 成骨誘導分化模型中發(fā)現(xiàn)Notch1蛋白水平降低，同時Notch1啟動子區(qū)甲基化水平較高，甲基轉移酶抑制劑處理VICs后 Notch1 細 胞 間 結 構 域（Notch1 intercellular domain，NICD）水平上調，β-catenin 通路被抑制，細胞成骨分化趨勢減弱，Notch1 啟動子甲基化則導致Wnt/β-catenin 途徑活化和成骨分化加劇，以上表明Notch 通路可能通過負向調控Wnt/β-catenin 激活發(fā)揮抑制VICs成骨分化的作用。此外，lncRNA H19在鈣化瓣膜中呈高表達，其啟動子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化水平，將H19 作用于VICs 成骨分化模型中，顯示過表達H19 促進細胞成骨分化，而敲低H19 則抑制成骨分化；進一步分析表明，H19過表達可直接導致轉錄因子p53蛋白水平降低，而p53作為Notch1表達的正向調控因子，其水平降低導致Notch1 表達減少，Notch通路被抑制，從而促進VICs成骨表型分化［51］。Vander Roest等［52］發(fā)現(xiàn)老齡（78周齡）C57BL6小鼠的主動脈瓣膜出現(xiàn)早期鈣化表現(xiàn)，但隨后的甲基化水平檢測并未發(fā)現(xiàn)其主動脈H19的甲基化水平與幼齡（26周齡）小鼠之間存在顯著差異，表明H19甲基化水平改變可能并非促成瓣膜鈣化的始動因素，其變化可能受其他因素調控。以上研究說明VICs 成骨分化通路中的成員，尤其是位于通路上游的關鍵信號分子對調節(jié)VICs成骨分化具有重要作用，這些關鍵分子DNA 的異常甲基化水平對下游分子表達產(chǎn)生不同影響，因此表觀遺傳學調控也是VICs成骨分化研究中又一值得關注的領域。

綜上所述，VICs 向肌成纖維樣細胞或者成骨樣細胞分化過程受多種因素調控，而2 種分化過程在CVD 患者病變瓣膜中往往共存，提示兩者之間存在內在關聯(lián)，針對分化機制的研究還需將兩者加以聯(lián)系。目前，已有大量有關VICs 分化機制的研究為CVD 的防治提供了多方向的策略與藥物設計靶點，但VICs體外實驗存在局限性，結合動物疾病模型以及體內實驗研究可能有助于VICs分化機制的完善。另外，關于脫離瓣膜微環(huán)境后的人工培養(yǎng)VICs，如何全面準確地再現(xiàn)其在體內的分化過程對今后的研究也是一個挑戰(zhàn)。