劉思穎，王斌，潘力

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州 510006）

甜葉菊原產于巴拉圭和巴西，其葉片中可提取出 一類甜度高且熱量低的糖苷類化合物，幾個世紀以來，一直被南美洲人作為天然甜味劑食用，包括甜菊苷（Stevioside，ST）、萊鮑迪苷A（Rebaudioside A，RA）、萊鮑迪苷D（Rebaudioside D，RD）和萊鮑迪苷（Rebaudioside M，RM）。其中ST和RA含量較為豐富（約占葉片干重的7%和3%），但與RD和RM相比，它們的甜度較低，且隨添加量不斷增加，苦澀味逐漸顯現(xiàn)，故應用于食品生產時會影響產品風味[1]。RD和RM作為高品質甜味劑，甜度為蔗糖的400倍，口感更加純凈，但是含量十分稀少，僅占葉片干重的0.3%[2]。利用傳統(tǒng)物理方法從葉片中提純RD和RM的產量遠遠不能滿足市場需求，且生產量少，工藝繁瑣，成本較高[3,4]。

甜葉菊來源的糖基轉移酶UGT76G1可以在糖基供體UDPG存在的條件下，催化兩種糖基轉移反應：由ST生成RA[5]，或由RD產生RM[6]，而水稻來源的糖基轉移酶EUGT11則可以利用糖基供體UDPG，以RA為底物催化生成RD[7]，糖基轉移酶UGT76G1和糖基轉移酶EUGT11都屬于UDP糖基轉移酶。在以上三個糖基轉移反應中，均需要UDPG作為糖基供體，但UDPG價格昂貴，使甜味劑的生產成本大幅增加。而蔗糖合成酶可利用廉價原料UDP，在蔗糖存在的情況下，將葡萄糖基轉移至UDP，生成UDPG和果糖（圖1b），且該過程可逆，可以實現(xiàn)UDP-UDPG的循環(huán)反應[8-11]。當糖基轉移反應與SUS1介導的UDP-UDPG循環(huán)反應偶聯(lián)時，不需要添加昂貴底物UDPG，各糖基轉移反應也能正常進行。

由于新型甜味劑RM更加符合人們對食物品質的追求，但目前關于體外一鍋法高效合成RM的論文報道較少。本文將UGT76G1，EUGT11和SUS1分別于大腸桿菌中重組表達，利用其破碎得到的粗酶液建立多酶級聯(lián)反應體系，即將三個單級聯(lián)反應串聯(lián)，在體外形成通路，由廉價原料ST經一鍋法合成RM（圖1a，1b）。并通過提高該通路中限速酶EUGT11酶活，將終產物RM產量提升，該方法避免直接用昂貴的RD作為合成RM的底物，為低成本高效酶法合成RM提供技術支持。

圖1 體外多酶級聯(lián)反應體系示意圖Fig.1 Process of multiple-enzyme cascade reactionsystem in vitro

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 目的基因、菌株及質粒

E.coliMatch1T1購自Invirtogen公司；E.coliRosetta（DE3）購自Invirtogen公司；通用載體質粒pET22b購自Takara公司；大腸桿菌表達質粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1、pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7、pET22b-EUGT11/4 copies of T7均由本實驗室構建。

1.1.2 酶及試劑

Restriction Enzymes FastDigest?購于賽默飛世爾科技公司；PCR高保真酶Prime STAR HS（premix）購自Takara公司；質粒小量提取試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；酶反應產物純化試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；UDP（尿苷二磷酸）及UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）均購自上海源葉公司；氨芐青霉素Amp及異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）均購自北京普博欣生物科技有限公司；ST、RA、RD及RM底物及標準品均由曲阜海根甜菊制品有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 目的基因序列合成及擴增

甜葉菊來源的糖基轉移酶UGT76G1，水稻來源的糖基轉移酶EUGT11及擬南芥來源的蔗糖合成酶SUS1的基因序列均由南京金斯瑞公司優(yōu)化合成，并分別克隆至載體pUC57，得到pUC57-UGT76G1、pUC57-EUGT11和pUC57-SUS1三個質粒。

1.2.2 表達載體構建

1.2.2.1UGT76G1、EUGT11和SUS1的單啟動子表達載體構建

以質粒pUC57-UGT76G1、pUC57-EUGT11和pUC57-SUS1為模板，分別用引物UGT76G1-F和UGT76G1-R、EUGT11-F和EUGT11-R、SUS1-F和SUS1-R（表1），將目的片段擴增，將大小正確的PCR產物并回收備用。用XhoⅠ和NdeⅠ酶切載體pET22b并純化，將純化后的載體分別和目的基因片段連接。將10 μL連接產物分別轉化至E. coliMatch1T1，涂布于含有氨芐霉素的LB平板。挑取陽性轉化子擴大培養(yǎng)后提質粒，經酶切驗證正確后，送至廣州天一輝遠基因科技有限公司測序，得到測序正確的質粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11及pET22b-SUS1，并將對應菌株于甘油中低溫保藏。

表1 用于載體構建的寡核苷酸序列Table 1 Sequences of oligonucleotides for plasmids construction

圖2 糖基轉移酶EUGT11表達載體Fig.2 Plasmids used for expression of UDP-glucosyltransferase EUGT11

1.2.2.2EUGT11多重啟動子表達載體構建

以質粒pET22b-EUGT11為模板，用pET22b-F和pET22b-R擴增得到含有和目的基因EUGT11的pET22b載體骨架的大片段，命名為pET22b-scaffold-EUGT11，膠回收備用。將2 copies of T7-F和2 copies of T7-R（表1）兩條寡核苷酸鏈在98 ℃條件下變性5 min，自然降至室溫完成退火，形成雙啟動子雙鏈片段，命名為2 copies of T7，回收該片段備用。將另外兩對寡核苷酸鏈3 copies of T7-F和3 copies of T7-R、4 copies of T7-F和4copies of T7-R（表1）也進行如上操作，分別退火形成三重啟動子和四重啟動子雙鏈片段，分別命名為3 copies of T7和4 copies of T7。將雙鏈片段2 copies of T7、3 copies of T7和4 copies of T7分別與pET22b-scaffold-EUGT11連接，轉化至大腸桿菌E. coliMatch1T1。經帶有氨芐霉素的抗性平板初步篩選陽性轉化子，將鑒定正確的轉化子送至廣州天一輝遠基因科技有限公司測序。得到含有雙重、三重、四重啟動子的EUGT11表達質粒，分別命名為pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7（圖2）。

1.2.3 大腸桿菌誘導表達

將質粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1、pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7分別轉化至Rosetta（DE3），經氨芐霉素抗性LB平板篩選陽性轉化子，分別命名為Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1、Rosetta-EUGT11/2 copies of T7、Rosetta-EUGT11/3 copies of T7和Rosetta-EUGT11/4 copies of T7。將以上重組大腸桿菌分別于液體LB中培養(yǎng)8 h，以1%接種量轉接于100 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，待菌體生長至OD600=0.7左右，向其中添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至工作濃度為0.5 mmol/L，并在20 ℃，200 r/min條件下低溫誘導培養(yǎng)。誘導20 h后，以4 ℃，8000 r/min離心收集菌體，30 mL超純水洗滌兩次，最后用10 mL 50 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液重懸菌體，冰浴超聲破碎30 min，離心取上清液得到粗酶液，用于后續(xù)BCA法蛋白濃度測定及酶活測定。

1.2.4 酶活測定

1.2.4.1 酶活測定體系

糖基轉移酶UGT76G1酶活測定體系：將Rosetta-UGT76G1破碎后得到的粗酶液與反應體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、1 mmol/L ST或1 mmol/L RD、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的總蛋白量為2 mg。反應30 min后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對UDP、UDPG進行定性定量分析。

糖基轉移酶EUGT11酶活測定體系：將Rosetta-EUGT11破碎后得到的粗酶液與反應體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液，1 mmol/L RA、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的總蛋白量為2 mg。反應30 min后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對UDP、UDPG進行定性定量分析。

蔗糖合成酶SUS1酶活測定體系：將Rosetta-SUS1破碎后得到的粗酶液與反應體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、700 mmol/L蔗糖、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，粗酶液中的總蛋白量為2 mg。反應30 min后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對UDP、UDPG進行定性定量分析。

1.2.4.2 酶活計算公式

酶活力單位定義為：各酶在相應反應條件下，每1 min生成1 mmol/L UDPG或UDP所需酶量。

式中：

C——通過標準曲線計算出的UDP、UDPG濃度，mmol/L；

N——稀釋倍數；

V——反應體系體積，L；

T——反應時間，min；

m——反應體系中的蛋白含量，g。

1.2.5 重組酶UGT76G1和EUGT11對糖苷類底物轉化率測定

重組酶UGT76G1對底物轉化率測定體系：將Rosetta-UGT76G1破碎后得到的粗酶液與反應體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、1 mmol/L ST或1 mmol/L RD、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，加入粗酶液的量為10 mU。反應24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活,超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對ST、RA或RD、RM進行定性定量分析，并計算ST或RD的轉化率。

重組酶EUGT11對底物轉化率測定體系：將Rosetta-EUGT11破碎后得到的粗酶液與反應體系混合，總體系為200 μL。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、1 mmol/L RA、2 mmol/L UDPG、3 mmol/L MgCl2，加入粗酶液的量為10 mU。反應24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對RA、RD進行定性定量分析，并計算RA的轉化率。

1.2.6 體外單級聯(lián)體系和體外多酶級聯(lián)體系產物測定

1.2.6.1 重組酶UGT76G1和SUS1參與的體外單級聯(lián)體系中ST轉化率測定

按照1.2.3的方法破碎獲得Rosetta-UGT76G1和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制體系中SUS1酶量為10 mU，UGT76G1酶量分別為10 mU、20 mU、30 mU，使得反應體系中雙酶酶量比例為1:1、1:2、1:3。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/L ST、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，補加蒸餾水至200 μL。反應24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對ST、RA進行定性定量分析，并計算ST轉化率。

1.2.6.2 重組酶EUGT11和SUS1參與的體外單級聯(lián)體系中RA轉化率測定

按照1.2.3的方法破碎獲得Rosetta-EUGT11和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制粗酶液的用量，使反應體系中SUS1酶活力為10 mU（換算成總蛋白質量為0.16 mg），EUGT11酶活力分別為10 mU、20 mU、30 mU（換算成蛋白質量分別為1.96 mg、3.93 mg、5.9 mg），使得反應體系中雙酶酶活力比例為1:1、1:2、1:3（換算成蛋白質量比為1:12.3、1:24.6、1:36.9）。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/L RA、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，補加蒸餾水至200 μL。反應24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對RA、RD進行定性定量分析，并計算各酶量配比下的RA轉化率。

破碎Rosetta-EUGT11/3 copies of T7得到的粗酶液也加入到同樣體系反應，Rosetta-EUGT11/3 copies of T7的粗酶液的用量為：保證反應體系中所含該粗酶液的蛋白質量與Rosetta-EUGT11粗酶液酶活力為10 mU、20 mU、30 mU時對應的蛋白質量一致，即分別為1.96 mg、3.93 mg、5.9 mg，具體為：使反應體系中SUS1酶活力為10 mU（換算成總蛋白質量為0.16 mg），Rosetta-EUGT11/3 copies of T7酶活力分別為21.3 mU、42.6 mU、63.9 mU，使得反應體系中雙酶酶活力比例為1:2.13、1:4.26、1:6.39。反應24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對RA、RD進行定性定量分析，并計算各酶量配比下的RA轉化率。

1.2.6.3 重組酶UGT76G1和SUS1參與的體外單級聯(lián)體系中RD轉化率測定

按照1.2.3的方法破碎獲得Rosetta-EUGT11和Rosetta-SUS1的粗酶液，控制體系中SUS1酶量為10 mU，UGT76G1酶量分別為10 mU、20 mU、30 mU，使得反應體系中雙酶酶量比例為1:1、1:2、1:3。其中各組份及終濃度為50 mmol/L pH 7.0磷酸鉀緩沖液、700 mmol/L蔗糖、1 mmol/LRD、2 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，補加蒸餾水至200 μL。反應24 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC對RD、RM進行定性定量分析，并計算RD轉化率。

1.2.6.4 重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1參與的體外多酶級聯(lián)體系產物測定

按照1.2.3的方法破碎獲得Rosetta-SUS1，Rosetta-UGT76G1和Rosetta-EUGT11的粗酶液，以酶活力比例為1:2:3加入反應體系中，即各酶酶活力分別為10 mU、20 mU、30 mU。其中各組份及終濃度為50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0）、700 mmol/L蔗糖、10 mmol/L ST、20 mmol/L UDP、3 mmol/L MgCl2，補加蒸餾水至200 μL。反應48 h后，95 ℃加熱5 min使酶失活，超純水稀釋10倍，0.22 μm濾膜過濾后，經HPLC分析對ST、RA、RD、RM進行定性定量分析。破碎Rosetta-EUGT11/3 copies of T7得到的粗酶液也按照同樣體系反應，Rosetta-EUGT11/3 copies of T7的粗酶液的用量為：保證反應體系中所含該粗酶液的蛋白質量與Rosetta-EUGT11粗酶液酶活力為30 mU對應的蛋白質量一致，即為5.9 mg。

1.2.6.5 底物轉化率計算公式

式中：

St0——反應結束時底物濃度，mmol/L；

St1——反應開始時底物濃度，mmol/L。

1.2.7 HPLC分析條件

HPLC分析RA、ST、RM、RD條件：Agilent 1220 Infinity梯度液相色譜系統(tǒng)，Phenomenex Luna 5μ C18柱，流動相為A（1.5 g/L磷酸二氫鈉緩沖液）:B（乙腈）=68:32，采用等度洗脫，進樣量10 μL，檢測波長210 nm。ST、RA、RD、RM標準品經以上條件分析后，得到外標法分析所用的標準曲線。

HPLC分析UDP、UDPG條件：Agilent 1220 Infinity梯度液相色譜系統(tǒng)，Phenomenex Luna 5μ C18 柱，流動相為A（200 mmol/L磷酸鹽緩沖液）：B（1.62 g/L四丁基溴化銨水溶液）=1:1，采用等度洗脫，進樣量10 μL，檢測波長262 nm。UDPG、UDP標準品經以上條件分析后，得到外標法分析所用的標準曲線。

1.2.8 數據處理

每個重組大腸桿菌重復發(fā)酵三次，每個蛋白濃度測定體系、酶活測定體系以及級聯(lián)反應體系均設置三個平行，數據值為平行樣品的平均值，用誤差線表示標準偏差。

2 結果與討論

2.1 重組酶UGT76G1、EUGT11、SUS1的表達研究

2.1.1 重組酶UGT76G1、EUGT11、SUS1表達載體構建

為了構建重組酶UGT76G1、EUGT11、SUS1表達載體，將目的基因UGT76G1、EUGT11、SUS1分別與線性化的pET22b載體連接，并對表達載體pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11及pET22b-SUS1進行瓊脂糖凝膠電泳及酶切鑒定。質粒的瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)大小為6717 bp、6747 bp、7767 bp的條帶（圖3），與各質粒大小一致。用XbaⅠ和NdeⅠ對質粒pET22b-UGT76G1雙酶切鑒定，用XbaⅠ和ClaⅠ對質粒pET22b-EUGT11雙酶切鑒定，釋放出的片段大小分別為5303 bp和1414 bp、5357 bp和1390 bp，條帶大小正確；用XbaⅠ對質粒pET22b-SUS1單酶切鑒定，得到大小為7767 bp的單一條帶，大小正確（圖3）。由 于 質 粒pET22b-EUGT11/2 copies of T7、pET22b-EUGT11/3 copies of T7和pET22b-EUGT11/4 copies of T7大小差距不大，只能依靠測序手段鑒定是否有相應個數的啟動子與載體連接，正確連接的載體如圖2。

圖3 質粒pET22b-UGT76G1、pET22b-EUGT11、pET22b-SUS1及酶切鑒定電泳圖Fig.3 Electropherogram of pET22b-UGT76G1, pET22b-EUGT11, pET22b-SUS1and their restriction enzymedigestion

2.1.2 重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1表達活性研究

分別對重組菌Rosetta-UGT76G1、Rosetta-EUGT11、Rosetta-SUS1破碎后得到的粗酶液進行酶活測定，以探究重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1在大腸桿菌胞內表達情況。糖基轉移酶UGT76G1，EUGT11催化UDPG轉化為UDP，故按照反應生成UDP的量計算酶活；SUS1催化UDP轉化為UDPG，按照反應生成UDPG的量計算酶活。結果如表2，UGT76G1（ST）、UGT76G1（RD）、EUGT11、SUS1酶活分別為31.35、19.27、5.09、65.34 U/g，宿主Rosetta（DE3）粗酶液基本無活性，表明重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1均已在大腸桿菌胞內成功表達。

其中，重組酶UGT76G1催化不同糖基轉移反應時，UDPG轉化率差異較大（表2，圖4c、4d），催化ST轉化為RA的酶活為催化RD轉化為RM酶活的1.63倍，可能是ST的分子構型相較于RD更易進入該酶的催化口袋而更快的觸發(fā)糖基轉移反應[12]，此時該酶對于糖基供體UDPG的葡萄糖基移除速率也更快，表現(xiàn)為該酶催化ST轉化為RA時也有更高的UDPG轉化率。重組酶EUGT11的酶活最低，反應結束只有少量UDP產生（圖4e），可初步認為在體外多酶級聯(lián)催化體系中，EUGT11是該體系的限速酶。重組酶SUS1的UDP轉化率最高，反應結束后UDP幾乎完全轉化為UDPG（圖4b），較高的酶活使得該酶能在體外多酶級聯(lián)反應體系中為糖基轉移反應提供足量糖基供體UDPG。

表2 重組大腸桿菌粗酶液酶活測定Table 2 Enzyme activity of crude lysates

圖4 UDP、UDPG的HPLC分析Fig.4 HPLC analysis of UDP, UDPG

2.2 重組酶UGT76G1和EUGT11對糖苷類底物轉化率研究

表3 重組酶UGT76G1和EUGT11粗酶液對底物的轉化率測定Table 3 Conversion rate of different substrates of UGT76G1 and EUGT11 crude lysates

為了確定體外多酶級聯(lián)反應體系中的限速酶，比較了在相同酶量下糖基轉移酶UGT76G1對ST和RD轉化率以及EUGT11對RA的轉化率。結果如表3，Rosetta-UGT76G1粗酶液對ST的轉化率為98.92%，對RD的轉化率為57.49%，Rosetta-EUGT11粗酶液對RA的轉化率僅為13.25%。由此可知，重組酶UGT76G1幾乎可以將ST完全轉化為RA，保證多酶級聯(lián)反應體系第一步反應的催化效率。重組酶EUGT11對RA的轉化率較低，導致RD產量低，不能為RM的合成提供足量的前體，故該步驟應為體外多酶級聯(lián)反應體系中的限速步驟。

2.3 在不同串聯(lián)個數啟動子操控下表達的重組酶EUGT11酶活比較

啟動子是轉錄調控的起始位點，啟動子與RNA聚合酶結合并起始轉錄，該過程直接影響到下游基因的轉錄水平。理論上多拷貝的啟動子可以增加DNA分子與聚合酶的作用的機率，即可以通過增加啟動子拷貝數，提高下游基因的轉錄效率，從而增加目的基因表達量而提高酶活力[13]。王俊姝[14]在大腸桿菌中，通過將化學合成五個重復trc啟動子核心區(qū)與載體連接，并以綠色熒光蛋白和半乳糖苷酶作為信號分子監(jiān)測啟動子的啟動強度，證明其啟動強度是單拷貝啟動子強度的3.47倍，該結果為本實驗在提高限速酶酶活方面提供了基本思路。為提升限速酶EUGT11活性，從而提升體外多酶級聯(lián)反應體系的整體催化效率，本文將該酶表達質粒的T7啟動子核心區(qū)域串聯(lián)，分別構建含有一重、二重、三重和四重啟動子的EUGT11表達質粒的重組大腸桿菌，并測定酶活，結果如表4，在相同反應條件下，重組酶EUGT11、EUGT11/2 copies of T7、EUGT11/3 copies of T7、EUGT11/4 copies of T7酶活分別為5.09、0.29、10.84、9.21 U/g。相比單啟動子控制下表達的重組酶EUGT11，三重啟動子將酶活提升2.13倍。四重啟動子也使得酶活提升1.81倍，而二重啟動子使得該酶的表達量大幅下降，酶活僅為0.29 U/g。

表4 不同串聯(lián)個數啟動子操控下表達的EUGT11酶活Table 4 Comparison of enzyme activity of EUGT11 with different number of promoters

2.4 體外各單級聯(lián)反應最佳酶量配比探究

為便于確定體外多酶級聯(lián)反應體系的酶量配比，先對各單級聯(lián)反應的最佳酶量配比進行探究。本文控制重組酶SUS1與重組酶UGT76G1的單酶級聯(lián)反應中的酶活力配比為1:1、1:2、1:3。由于多重啟動子中，三重啟動子對重組酶EUGT11酶活提升效果最佳，故選擇重組菌Rosetta-EUGT11/3 copies of T7破碎液進行以RA為底物的單酶級聯(lián)反應最佳酶量配比探究，并以重組菌Rosetta-EUGT11破碎液做為對照，本文控制重組酶SUS1與重組酶EUGT11或重組酶EUGT11/3 copies of T7的單酶級聯(lián)反應中蛋白質量配比為1:2.3、1:24.6、1:36.9。比較三種酶活力或蛋白質量配比下各糖基轉移酶對底物的轉化率，轉化率最高時的酶活力或蛋白質量配比為該單級聯(lián)反應的最佳酶活力或蛋白質量配比，結果如圖5。

重組酶EUGT11和EUGT11/3 copies of T7催化RA轉化為RD的單級聯(lián)反應情況如圖5a和5b，SUS1與EUGT11的酶活力配比為1:1、1:2、1:3時，RA的轉化率分別為19.07%、29.10%、36.56%；SUS1與EUGT11/3 copies of T7的酶活力配比為1:2.13、1:4.26、1:6.39時，RA的轉化率分別為25.68%、63.60%、79.75%。由此可知，單啟動子控制下的EUGT11和三重啟動子控制下的EUGT11在酶量配比為1:3和1:6.39時（即蛋白質量配比均為1:36.9時）出現(xiàn)RA最高轉化率，且后者最高轉化率為前者的2.18倍。

重組酶UGT76G1催化ST轉化為RA的單級聯(lián)反應結果如圖5c，SUS1與UGT76G1的酶量配比為1:1、1:2、1:3時，ST轉化率分別為89.17%、95.28%、87.89%。當酶量配比為1:2時，ST轉化率最高，再增加糖基轉移酶的量至酶量配比為1:3時，產物RA轉化率略有降低。

圖5 單級聯(lián)反應中SUS1和UDP糖基轉移酶不同酶量配對應的底物轉化率Fig.5 Substrate conversion rate with different ratios of SUS1 and UDP-glucosyltransferase in cascade reaction

重組酶UGT76G1催化RD轉化為RM的單級聯(lián)反應結果如圖5d，SUS1與UGT76G1的酶量配比為1:1、1:2、1:3時，RD轉化率分別為89.57%、99.26%、35.92%。當酶量配比為1:2時RD轉化率最高，再增加UGT76G1至酶量配比為1:3時RD轉化率大幅降低?？赡苡捎诿噶颗浔葹?:2時，該級聯(lián)反應中SUS1的糖基供體UDPG供應速度與UGT76G1轉糖基速度達到最優(yōu)平衡，若再增加糖基轉移酶的量，使UDPG消耗量加大，在SUS1酶量不變的情況下，UDPG的產生速度跟不上消耗速度，可能會在一定程度上破壞偶聯(lián)反應的平衡，使RD的轉化率降低。

將每個單酶級聯(lián)反應體系的最佳酶活力配比綜合，則體外多酶級聯(lián)反應體系最佳酶活力配比應為SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39，換算成蛋白質量比例為SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:4:36.9。

2.5 三重啟動子操控下表達的EUGT11對體外多酶級聯(lián)反應體系中RM產量探究

圖6 體外多酶級聯(lián)反應體系HPLC產物分析Fig.6 HPLC analysis of production in different multiple-enzyme cascade reaction in vitro

表5 不同體外多酶級聯(lián)反應體系RA、RD、RM濃度比較Table 5 Comparison of concentration of RA, RD and RM in different multiple-enzyme cascade reaction in vitro

為了研究EUGT11的表達效率對體外多酶級聯(lián)反應體系終產物RM產量的影響，將單啟動子操控下表達的EUGT11參與的反應體系SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3（對照組）與三重啟動子操控下表達的EUGT11參與的反應體系SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39（實驗組）在相同條件下反應48 h后，用HPLC對反應后各體系中的ST、RA、RD、RM進行定量分析，結果如圖6和表5所示。反應進行48 h后，在體系SUS1:UGT76G1:EUGT11=1:2:3中，10 mmol/L ST轉化為7.85 mmol/L RA，2.29 mmol/L RD和1.61 mmol/L RM；在體系SUS1:UGT76G1:EUGT11/3 copies of T7=1:2:6.39中，10 mmol/L ST轉化為3.14 mmol/L RA，5.76 mmol/L RD和3.79 mmol/L RM（表5）。在兩個體系中，ST均完全轉化為RA，而在三重啟動子控制下的EUGT11參與的體系中，由于RA轉化率提升，使得RD和RM產量均高于單重啟動子控制下的EUGT11參與的反應體系（圖6）。相比單重啟動子控制下的EUGT11參與的反應體系，三重啟動子控制下的EUGT11使得反應結束時RD產量提升2.52倍，RM產量也隨之提升2.35倍。

3 討論

UGT76G1和EUGT11是目前甜菊醇糖苷類物質酶法生產中較常使用的糖基轉移酶，但多數生產方法僅利用單個酶與蔗糖合成酶偶聯(lián)產生單一種類的糖苷，且產物大多為RA或RD。朱清娟[15]利用重組畢赤酵母制備的粗酶液，在體外偶聯(lián)UDP-糖基轉移酶與蔗糖合成酶，將10 mmol/L ST轉化合成8.20 mmol/L RA。楊玉鳳[16]利用重組大腸桿菌全細胞催化1 mmol/L RA轉化為0.1 mmol/L RD。而本文利用大腸桿菌表達的重組酶UGT76G1、EUGT11和SUS1搭建體外反應通路，使廉價底物ST先經UGT76G1催化為RA，再經EUGT11催化產生RD，最后經UGT76G1轉化為RM，該體外反應通路旨在利用較簡單的生產方法得到更高品質的甜味劑RM。

4 結論

3.1 本文通過比較重組酶UGT76G1對ST和RD的轉化率以及EUGT11對RA的轉化率，得知EUGT11對底物RA的轉化率最低，僅13.25%，而該酶參與的糖基轉移反應正是產生RM的前體RD的關鍵一步，因此，提升該酶酶活是提升終產物RM產量的關鍵。為提升該限速酶酶活，構建了三重啟動子操控下表達的重組酶EUGT11，相比單啟動子操控下表達的重組酶EUGT11，三重啟動子使其酶活提升2.13倍。當三重啟動子操控下表達的重組酶EUGT11參與整個體外多酶級聯(lián)反應體系時，RD產量提升2.52倍，RM產量也隨之提升2.35倍，該反應體系將10 mmol/L ST轉化為3.79 mmol/L RM。

3.2 本文提供的RM合成方法與直接催化RD生產RM的方法相比，底物廉價，催化效率較高，為此后RM生物合成的工業(yè)應用提供新思路。但該一鍋法催化所得產物成分較復雜，含有多種糖苷類物質，RM不易從眾多性質相似的成分中分離。為得到純度更高的RM，可以繼續(xù)挖掘更優(yōu)質的糖基轉移酶基因，或用異源表達量大且本底表達量低的宿主進行糖基轉移酶和蔗糖合成酶的異源表達，旨在獲得純度更高的RM。