李金梁，彭晶晶，楊潔，蘭惠晶，張夢瑤，郭安鵲,2*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100）（2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西楊凌 712100）

葡萄酒的適量氧化有利于其成熟（如利用橡木桶陳釀），但是過度氧化通常會導致褐變，嚴重影響葡萄酒的感官品質和營養(yǎng)價值[1]。葡萄酒的氧化主要表現(xiàn)為酚類物質（特別是鄰羥基酚）的氧化，鐵（Fe）離子在引發(fā)和延伸葡萄酒氧化反應中起著關鍵催化作用[1-3]，共存的銅（Cu）、錳（Mn）離子具有氧化增效作用[4,5]。隨著現(xiàn)代釀酒技術和設備的不斷改進，葡萄酒中Fe、Cu、Mn等的含量已經大幅度降低[4,6]。然而，氧化褐變現(xiàn)象依然普遍存在[7,8]，這與葡萄酒中上述金屬的化學形態(tài)及其分布密切相關[9]。

元素形態(tài)是指某種元素在原子和分子結構水平上存在顯著差異的各種存在形式，包括元素的價態(tài)、化合態(tài)和絡合態(tài)等[10]。較之總濃度，葡萄酒中金屬的形態(tài)不僅決定了金屬的生物可利用性和毒性，也會對葡萄酒的氧化產生實質性影響[11-13]。在葡萄酒中，具有鄰羥基結構的酚類物質（氧化底物）能夠將Fe3+還原為Fe2+，促進氧化反應[14]；酒石酸和蘋果酸能夠與Fe3+形成穩(wěn)定絡合物，一定程度上抑制酚類物質的氧化[15]；pH變化會影響絡合物的溶解性及其穩(wěn)定性[16]；氨基酸、多肽[17]、蛋白[12]、多糖[18]等也會影響金屬的存在形態(tài)。因此，葡萄酒的氧化除了與金屬的總量有關，更多地取決于其形態(tài)分布。然而，目前有關金屬形態(tài)分析技術的報道很少，且多局限于價態(tài)的檢測[19]。

葡萄酒成分復雜，金屬元素形態(tài)分析面臨基質干擾、形態(tài)轉化等諸多挑戰(zhàn)，利用高靈敏檢測技術進行元素形態(tài)分析之前，從樣品中分離出目標元素的各個形態(tài)已成為形態(tài)分析技術的關鍵[20]。當前常用的形態(tài)分離與富集方法主要包括液液萃取、固相萃?。⊿PE）、膜分離和共沉淀法等[21]。其中，SPE法由于選擇性強、回收率高、有機溶劑使用少等諸多優(yōu)勢[22]，已經成為一種現(xiàn)代高效的通用型樣品前處理技術[20,22]。近年來，串聯(lián)使用雙柱SPE技術對樣品進行預處理，結合火焰原子吸收法（FAAS）或電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）被成功用于葡萄酒中Fe、Cu等金屬形態(tài)的測定[9,12]。然而，對于含有豐富多酚類物質的葡萄酒或其他飲料，傳統(tǒng)的C18固相萃取柱主要萃取非極性的酚類物質，對強極性酚類物質（羥基苯甲酸、羥基肉桂酸及其衍生物）的吸附能力差、回收率低[21,23]，而具有兒茶酚或沒食子酰基結構的原兒茶酸、咖啡酸、沒食子酸等能與金屬離子（尤其是Fe3+）形成穩(wěn)定絡合物[25,26]，C18柱并不適用于萃取葡萄酒中多種不同性質的酚類物質。與C18柱相比，以高聚物二乙烯基苯-乙烯吡咯烷酮為吸附劑的HLB固相萃取柱優(yōu)勢明顯，更加適合保留樣品中低含量的酚類物質[22,24]。

本實驗通過利用HLB柱代替C18柱、優(yōu)化雙柱固相萃取條件，以及在模擬葡萄酒中考察pH值、有機酸對測定結果的影響，結合方法可靠性評價，構建一種快速準確、適用于葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)分析的新技術，這對于明晰葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)分布特征，深入研究葡萄酒氧化機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試酒樣

酒精水溶液（12%，V/V）、模擬酒；國產瓶裝紅葡萄酒（2017年赤霞珠干紅，共5款）和白葡萄酒（4款霞多麗干白：2017年3款，2019年1款；2015年雷司令干白1款），來自甘肅紫軒酒業(yè)、寧夏御馬酒莊、云南香格里拉酒業(yè)、新疆芳香莊園和絲路酒莊等企業(yè)，均為當?shù)仄咸言纤勆唐菲咸丫啤?/p>

酒精水溶液（12%，V/V）：室溫下制備，每100 mL溶液中含有12 mL無水乙醇。以此為溶劑，通過添加金屬離子、單寧酸或有機酸，分別獲得含金屬離子、（單寧酸+金屬離子）和有機酸的酒精水溶液，均現(xiàn)配現(xiàn)用。除非特別說明，上述溶液中的金屬濃度為2000 μg/L Fe3+、500 μg/L Cu2+和2000 μg/L Mn2+，單寧酸濃度為500 mg/L。

模擬酒：參照郭安鵲等[27]的方法，配制含18 mmol/L (+)-酒石酸的酒精水溶液（12%，V/V），利用1 mol/L NaOH調節(jié)溶液的pH值為3.20。充氮氣后于室溫下避光放置。

1.2 儀器與試劑

Agilent AA 240Z石墨爐原子吸收光譜儀（GFAAS），美國Agilent公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；BT100FJ六通道數(shù)字分配型蠕動泵，保定創(chuàng)銳泵業(yè)有限公司；FHO-7023 12位固相萃取裝置，廣州菲羅門科學儀器有限公司。Polyclean X-HLB（反相固相萃取柱，500 mg/6 mL）和Superclean SCX（陽離子交換固相萃取柱，500 mg/6 mL），廣州菲羅門科學儀器有限公司。標準品：1000 mg/L Fe3+、Cu2+（AAS級），1000 mg/L Mn2+、Zn2+、Al3+（ICP級），美國Sigma-Aldrich公司。L-酒石酸（99.5%）、L-酒石酸氫鉀（99%）、L-蘋果酸（99%）、檸檬酸（≥99.5%）、乳酸（≥85%）、琥珀酸（≥99.0%），分析純，Sigma-Aldrich公司。乙酸，≥99.5%，分析純，廣東光華科技股份有限公司。濃硝酸，65%～68%（V/V），優(yōu)級純，洛陽昊華化學試劑有限公司；濃鹽酸，36%～38%，優(yōu)級純，四川西隴科學有限公司；NaOH，≥98%，優(yōu)級純，天津市光復科技發(fā)展有限公司；無水乙醇，分析純，四川西隴科學有限公司。實驗用水均為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）。

實驗中所使用玻璃和塑料器材等均用10% HNO3（體積分數(shù)）浸泡過夜，再用超純水沖洗干凈，晾干后使用。

1.3 固相萃取柱活化

參照Polyclean X-HLB柱活化方法和Kontoudakis等[9]的研究報道，設置4種活化平衡方式：20 mL甲醇→30 mL水（方式1，“→”代表沿箭頭方向順序通過）；20 mL甲醇→30 mL水→20 mL模擬酒（方式2）；20 mL甲醇→30 mL水→10 mL 1 mol/L的鹽酸→20 mL模擬酒（方式3）；20 mL甲醇→30 mL水→10 mL1 mol/L的鹽酸→30 mL水→20 mL模擬酒（方式4）。目前，SCX柱活化方法較為成熟、一致[9,28]。Superclean SCX柱的活化方式為：40 mL水→10 mL1 mol/L的鹽酸→20 mL水→10 mL1 mol/L的NaOH→40 mL水。

借助固相萃取裝置和真空泵，使各試劑以1～2 mL/min的流速依次通過小柱。過完試劑后，持續(xù)抽真空10 min左右去除SPE柱中殘留的水分。

1.4 酒樣中各金屬形態(tài)的提取方法

抽取15 mL酒樣，通過蠕動泵控制樣品以1 mL/min流速首先通過Polyclean X-HLB柱：取5 mL流出液（餾分1）測定目標金屬含量，疏水態(tài)含量就等于樣品中金屬總量減去餾分1中的金屬含量[9]；剩余的10 mL流出液隨后以2 mL/min的流速通過Superclean SCX柱，獲得殘留態(tài)溶液（餾分2，用于測定酒樣中目標金屬的殘留態(tài)含量）。最后，利用2 mol/L HNO3洗脫SCX柱，收集洗脫液（洗脫液1，用于測定金屬的陽離子含量），也可通過餾分1和餾分2的差值進行比較驗證。由上可知，金屬總量=疏水態(tài)+陽離子+殘留態(tài)。

1.5 原子吸收光譜測定條件

空白溶液：1% HNO3溶液。標準溶液：使用1% HNO3溶液將Fe3+、Cu2+、Mn2+標準溶液稀釋，配制成200 μg/L的標準物質儲備液。

標準曲線繪制：以1% HNO3溶液為參比，利用石墨爐原子吸收光譜儀（GFAAS）分別測定5個質量濃度梯度的Fe3+（0、20、40、100、160 μg/L）、Cu2+（0、20、40、60、100 μg/L）和Mn2+（0、20、40、100、140 μg/L）標準溶液。Fe的測定波長是372.0 nm，狹縫寬度0.2 nm，燈電流5.0 mA；Cu的分析波長是327.4 nm，狹縫寬度0.5 nm，燈電流4.0 mA；Mn的分析波長是403.1 nm，狹縫寬度0.2 nm，燈電流5.0 mA。以高純氬氣為保護氣體，以峰高定量，進樣體積為10 μL。儀器通過設定程序自動采集空白溶液和標準溶液系列，繪制標準曲線。GFAAS溫度程序和氣體流量如表1所示。

根據(jù)酒樣中金屬實際含量使用1% HNO3進行適當稀釋后，直接進樣測定，結果由標準曲線計算獲得。

1.6 方法的靈敏度

通過檢測限LOD（產生高于系統(tǒng)噪聲水平可檢測到響應的最低分析物濃度）和定量限LOQ（可準確和精確測量分析物的最低水平）評估方法的靈敏度[29]。

式中：

σ——空白樣品多次測量值的標準差（n=9）；

S——分析曲線斜率[30]。

表1 測定Fe、Cu、Mn的石墨爐溫度程序Table 1 Graphite furnace temperature program for determination of Fe, Cu and Mn

表2 活化方式對Polyclean X-HLB柱流出液中金屬離子通過率的影響Table 2 Effects of activation methods on the throughput rates of metal ions in liquid effluents from the polyclean X-HLB column

1.7 方法的準確度和精密度

為了評價串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜法的準確性，對紅葡萄酒、白葡萄酒及其餾分進行加標實驗計算回收率。

回收率/%=100×(C1-C0)/C’

式中：

C1——加標后樣品中金屬的濃度，μg/L；

C0——加標之前樣品中金屬的濃度，μg/L；

C’——加到酒中的分析物的標準濃度[29]，μg/L。

每種金屬的加標濃度各設兩個水平：低濃度Fe3+或Mn2+為500 μg/L，高濃度為2500 μg/L；低濃度Cu2+為20 μg/L，高濃度為500 μg/L。

選擇白、紅葡萄酒各一款，利用新建方法對原始酒樣及其餾分中金屬含量重復測定6次，計算相對標準偏差（% RSD），評估方法的精密度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

借助數(shù)據(jù)處理軟件DPS V6.50獲得實驗數(shù)據(jù)的ANOVA（Duncan新復極差法），每個處理重復3次，其結果以平均值±標準差表示。利用Microsoft excel 2010和Origin 2018進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 Polyclean X-HLB柱的活化

結果如表2所示，在僅含金屬離子的酒精水溶液中，4種活化方式對HLB柱吸附Cu2+、Mn2+的影響很少，但是對Fe3+具有顯著影響；活化方式4表現(xiàn)最佳，3種金屬離子通過率（流出液中金屬含量占金屬總量的百分比）最高（均不低于93.71%）。由于單寧酸的鄰酚結構可以與金屬離子配合形成穩(wěn)定的絡合物[31]，其加入后，3種金屬的存在形態(tài)發(fā)生改變（Fe3+幾乎全部被單寧酸絡合），流出液中金屬濃度均下降，但是不同活化方式之間的差異不顯著。因此，選擇方式4進行HLB柱的活化和平衡。

Pohl等[11-13]發(fā)現(xiàn)，在含單寧酸的酒精水溶液（pH 3.00～5.00）中：20%～85% Fe3+被Amberlite XAD-7HP柱保留，10%～35% Cu2+和9%～13% Mn2+被Amberlite XAD-16柱保留。相比Amberlite XAD系列固相萃取柱，在本實驗條件下（pH=2.88），Polyclean X-HLB柱對上述金屬離子的單寧酸絡合物均具有更高的保留率，有效保證了葡萄酒中金屬疏水態(tài)含量檢測的準確性。

2.2 SPE柱流速對金屬離子通過率的影響

樣品分別以1、2、3 mL/min流速通過Polyclean X-HLB柱或Superclean SCX柱，結果如表3所示。含有金屬離子的樣品流經HLB柱后，流速僅對Fe3+產生了顯著影響（隨流速增加，流出液中Fe3+百分比濃度從93.71%降至79.43%）；1 mL/min和2 mL/min處理之間的差異不顯著，這與文獻報道的結果一致[11-13]；單寧酸加入后，流出液中Fe3+的濃度下降最大，且同一金屬離子不同流速之間的差異并不顯著（表3）。與酒精水溶液相比，葡萄酒成分更為復雜，所以選擇1 mL/min作為HLB柱的最佳流速。

同樣，由表3可知，僅含金屬離子的樣品流經SCX柱后，3種金屬陽離子幾乎全部被吸附，流速為2 mL/min的效果最好；加入的單寧酸由于與Fe3+形成穩(wěn)定絡合物，不能被SCX柱保留，所以通過率很高（≥75.77%）?？紤]到萃取時間過長可能會造成金屬形態(tài)轉化問題，選擇2 mL/min作為SCX柱的最佳流速，這與已有文獻報道的1 mL/min略有不同[9,11-13,28]。

表3 流速對SPE柱流出液中金屬離子通過率（%）的影響Table 3 Effects of different speeds on the throughput rates of metal ions in liquid effluents from SPE columns

表4 洗脫劑對SPE柱流出液中金屬離子回收率（%）的影響Table 4 Effects of eluting agents on the recoveryof metal ions in liquid effluents from SPE columns

表5 共存Zn2+和Al3+對SPE柱流出液中金屬離子通過率的影響Table 5 Effects of Zn2+ and Al3+on the throughput rates of metal ions in liquid effluents from SPE columns

2.3 SPE柱洗脫劑對金屬離子回收率的影響

以1、2、3 mol/L鹽酸或硝酸溶液為洗脫劑，分別對樣品經過的Polyclean X-HLB柱和Superclean SCX柱進行洗脫，洗脫效果以回收率（洗脫液中金屬離子含量與洗脫前SPE柱上吸附金屬離子含量的比值）表示。結果顯示（表4），對于Polyclean X-HLB柱，除了鹽酸對Fe3+的洗脫結果（回收率≥98.27%）令人滿意外，其他處理的洗脫效果均不理想。Pohl及其合作者也在相關研究中發(fā)現(xiàn)了同樣的問題，所以建議采用差減法計算疏水態(tài)含量[11-13]，即利用樣品中的金屬總量減去流出液中的含量就等于疏水態(tài)含量。

對于Superclean SCX柱，不同濃度的鹽酸或硝酸洗脫后3種金屬離子的回收率均令人滿意，其中2 mol/L硝酸表現(xiàn)出最好的洗脫能力和穩(wěn)定性，回收率為98.34%～99.29%（表4）。

2.4 共存Zn2+和Al3+對金屬離子通過率的影響

有研究表明，K+、Na+、Ca2+、Mg2+和Fe3+、Cu2+、Mn2+同時通過固相萃取柱時不會對分離結果產生影響[12,13]。向只含金屬離子的酒精水溶液中添加1 mg/L Zn2+和0.5 mg/L Al3+，在上述優(yōu)化萃取條件下，依次通過Polyclean X-HLB和SupercleanSCX柱。測定結果表明（表5），共存Zn2+和Al3+沒有對過柱后3種金屬離子的分離結果產生顯著影響。

2.5 葡萄酒中Fe、Cu、Mn含量檢測方法的評價

2.5.1 標準曲線的線性

以Fe、Cu、Mn各自的質量濃度（μg/L）為橫坐標、吸光度為縱坐標，得到鐵標準曲線為y=0.0031x+0.0014，決定系數(shù)R2為0.9997；銅標準曲線為y=0.0056x+0.0391，R2為0.9919；錳標準曲線為y=0.0047x+0.0154，R2為0.9992。說明Fe、Cu和Mn在所設質量濃度范圍內線性關系良好。

2.5.2 靈敏度

通過計算3倍多次空白的標準差σ除以分析曲線的斜率S可知，F(xiàn)e、Cu、Mn的LOD值分別為1.56 μg/L、0.55 μg/L和0.39 μg/L，LOQ值分別為5.21 μg/L、1.83 μg/L和1.30 μg/L。說明方法的靈敏度高。

2.5.3 準確度和精密度

加標回收實驗的結果顯示（表6），白葡萄酒及其各餾分中Fe、Cu、Mn的加標回收率分別是92.49%～106.37%、96.68%～112.18%、94.03%～ 107.67%；紅葡萄酒及其各餾分中Fe、Cu、Mn的加標回收率分別是92.04%～110.39%、90.53%～109.65%、101.94%～110.16%。表明方法的準確性良好。

對原始酒樣及其餾分中金屬含量重復測定6次的結果顯示，F(xiàn)e的相對標準偏差（%RSD）為1.59%～ 6.55%，Cu的相對標準偏差為3.55%～7.12%，Mn的相對標準偏差為0.89%～6.33%，說明方法的精密度良好。

表6 白葡萄酒和紅葡萄酒及其餾分、洗脫液在不同加標濃度下的回收率（%）Table 6 The recoveries (%) of white, red wine, their effluents and eluates in samples with two spiked levels

表7 pH對SPE柱流出液中金屬離子回收率的影響Table 7 Effects of pH on the throughput rates of metal ions in liquid effluents from SPE columns

2.6 pH和有機酸對模擬葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)測定的影響

2.6.1 pH的影響

為了解pH對Fe3+、Cu2+、Mn2+形態(tài)的影響，采用0.05 mol/L鹽酸和0.05 mol/L NaOH調節(jié)12%（V/V）酒精水溶溶液的pH值為3.00、3.50和4.00（葡萄酒pH值范圍）；靜置2 h后，各樣品分別通過Polyclean X-HLB和Superclean SCX柱。

結果表明（表7），F(xiàn)e3+對pH變化非常敏感，在實驗pH條件下，93%以上被HLB柱吸附，僅有50%左右通過SCX柱；隨著pH值增加，Cu2+通過HLB柱的百分比下降，約有20%左右通過SCX柱；Mn2+對pH變化不敏感，90%以上通過HLB柱，約有95%被SCX柱保留。pH變化對Fe、Cu形態(tài)的影響，很可能與Fe(OH)3等膠體的形成及后續(xù)沉淀有關[32,33]。水中的研究顯示，當Fe3+濃度為5mg/L時，F(xiàn)e3+在pH為3.36時就開始產生Fe(OH)3，pH為4.01時完全沉淀[34]。

2.6.2 有機酸的影響

葡萄酒中常見的有機酸（酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸等），由于含有羥基官能團，能夠和鐵離子形成可溶性絡合物[35,36]，通過改變鐵的形態(tài)分布而影響葡萄酒的氧化過程[37]。利用建立的串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜法，在酒精水溶液12%（V/V）中研究了不同pH條件下有機酸及其組合對酒樣中Fe3+、Cu2+、Mn2+形態(tài)分布的影響。各有機酸濃度接近其在葡萄酒中的實際含量[15]。

結果表明（圖1），有機酸種類、pH對Fe3+、Cu2+的存在形態(tài)具有顯著影響，而對Mn2+的形態(tài)分布（以陽離子為主，平均占Mn總量的91.44%）影響很小。如圖1所示，在模擬葡萄酒環(huán)境條件下，F(xiàn)e3+因與酒石酸、蘋果酸、檸檬酸絡合主要以殘留態(tài)存在（在pH 3.50～4.00時表現(xiàn)尤為明顯），而由于與乳酸配合作用弱而以陽離子為主（雖然pH上升一定程度上提高了殘留態(tài)的百分比）；Cu2+形態(tài)對pH值變化非常敏感（酒石酸和檸檬酸表現(xiàn)最突出，其次是蘋果酸，乳酸最弱）：pH 3.00時主要是陽離子（≥86.48%），隨著pH值增加，其百分比顯著下降并伴隨著殘留態(tài)顯著上升，至pH 4.00時酒石酸和檸檬酸溶液中的Cu2+以殘留態(tài)為主，分別占到了60.44%和83.13%；與單一有機酸（主要是酒石酸、蘋果酸和檸檬酸）相比，混合有機酸之間表現(xiàn)出對絡合金屬離子的競爭關系，很大程度上降低了陽離子的百分比而增加了疏水態(tài)的百分比（可能與其他酸加入后引起pH值下降有關）。

圖1 不同pH條件下有機酸對酒精水溶液中Fe3+、Cu2+、Mn2+形態(tài)分布的影響Fig.1 Effects of organic acids on fraction distribution of ferric, cupric and Mn (II) ions in alcoholic solutions with different pH values

不同有機酸、pH對金屬形態(tài)影響的差異，主要與它們在模擬葡萄酒中的離解程度、酸根離子與金屬離子之間的相互作用強弱有關：相比于弱配體乳酸、琥珀酸和乙酸，酒石酸、蘋果酸和檸檬酸與Fe3+絡合作用更強，且混合有機酸之間存在相互競爭關系[15]；通常情況下，有機酸絡合作用依賴于pH值（金屬離子和H+都要爭奪配體），在葡萄酒pH條件下，蘋果酸和酒石酸與Fe3+具有相似的絡合能力[37]，這與本實驗的研究結果（pH 3.50～4.00）一致。另外，與上文“2.6.1 pH的影響”結果相比，由于有機酸與金屬離子（如Fe3+和Cu2+）形成了穩(wěn)定的可溶性絡合物，改變了金屬的形態(tài)分布（疏水態(tài)濃度降低），它們的加入提高了金屬離子的溶解性[38]。

2.7 葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)的測定

選擇瓶裝白、紅葡萄酒各5款，利用串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜法，分析酒樣中Fe、Cu、Mn的形態(tài)及其分布特征，結果如圖2所示。就金屬總量而言，不同酒樣之間的差異比較大：紅葡萄酒中Fe、Cu的平均含量（分別為2.23、0.15 mg/L）均比白葡萄酒中的（分別為0.88、0.09 mg/L）高，兩種類型酒中Mn的含量非常接近（平均值分別為1.98、2.27 mg/L）。金屬形態(tài)分析的結果表明（圖2），酒樣中同一金屬的3種形態(tài)之間差異顯著；相同類型葡萄酒中Fe或Mn的形態(tài)分布比較穩(wěn)定（樣品間差異?。?，而Cu的形態(tài)分布變化很大（樣品間變化較大）；酒樣中Fe、Mn均主要以殘留態(tài)存在（平均分別占金屬總量的69.79%和58.05%），而Cu在白葡萄酒（以殘留態(tài)為主，平均占45.62%）和紅葡萄酒（以疏水態(tài)為主，平均占65.60%）中表現(xiàn)不同；Fe陽離子、Mn陽離子、Cu疏水態(tài)在白葡萄酒中排名其次，F(xiàn)e疏水態(tài)、Cu殘留態(tài)和Mn陽離子則在紅葡萄酒中排名第二。

如前所述，酚類物質很容易與鐵離子形成穩(wěn)定絡合物，所以與白葡萄酒相比，F(xiàn)e在富含酚類物質的紅葡萄酒中具有更多的疏水態(tài)；Cu在葡萄酒中具有較多的疏水態(tài)，這與Kontoudakis等[9]的研究結果相同。研究顯示，葡萄酒中的鐵離子主要以絡合態(tài)存在[1]，總體上白、紅葡萄酒中的Fe應以殘留態(tài)為主，這與本研究的結果一致。然而，Kontoudakis等[9]卻發(fā)現(xiàn)白葡萄酒中鐵的主要形態(tài)是陽離子。這可能與葡萄酒本身的化學成分和氧化還原狀態(tài)有關：一方面，鐵形態(tài)與有機酸種類、pH有關，如在低pH值蘋果酸酒精水溶液中以陽離子為主；另一方面，葡萄酒的氧化還原狀態(tài)決定了Fe2+/Fe3+比率[19]，如酒石酸、蘋果酸能夠與Fe3+形成穩(wěn)定絡合物，但是與Fe2+的絡合作用卻很弱[37]，最終影響了酒樣中各種鐵形態(tài)的分布。該團隊也認為這可能與鐵-有機酸絡合物的解離和低pH條件有關[9]。目前，有關葡萄酒中Mn形態(tài)的研究還很少。然而，基于白、紅葡萄酒中較高的Mn總量和陽離子比例，以及其在葡萄酒氧化反應中的重要作用，應當在今后研究中對Mn元素引起足夠的重視。

圖2 商品葡萄酒中Fe、Cu、Mn的形態(tài)分布Fig.2 Fraction distribution of Fe, Cu and Mn in commercial white (W) and red (R) wines

3 結論

3.1 構建出一種適用于葡萄酒中Fe、Cu、Mn形態(tài)檢測的串聯(lián)雙柱固相萃取-原子吸收光譜技術，可有效測定金屬的疏水態(tài)、陽離子和殘留態(tài)。確定了Polyclean X-HLB最佳活化條件和最佳流速（1 mL/min），明晰了Superclean SCX的最佳流速（2 mL/min）和洗脫劑（2 mol/L硝酸）；該法快速高效、準確可靠，也可用于其他酒精飲料中金屬形態(tài)的檢測。

3.2 在葡萄酒環(huán)境條件下，pH對Fe3+和Cu2+的形態(tài)具有顯著影響，但是對Mn2+的形態(tài)影響很??；與單一有機酸相比，混合有機酸之間存在對金屬離子的競爭絡合關系，很大程度上提高了金屬離子的溶解性。 3.3 白、紅葡萄酒中Fe、Cu、Mn的形態(tài)分布特征不同，這與葡萄酒的成分和氧化還原狀態(tài)密切相關。