劉娜，趙琳娜，王學碩，崔生輝

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種嗜鹽細菌[1]，主要污染海產(chǎn)品，如貝類、海魚、海蝦等均是常見的被污染物，甚至高鹽腌制的食品如咸菜、腌肉等也能分離出副溶血性弧菌。海鮮盛產(chǎn)的夏秋季節(jié)，是由于食用被副溶血性弧菌污染食物而引起的食物中毒事件[2-4]的高發(fā)時段。隨著人民生活水平的提高以及漁業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)在人們四季均可以食用到各色海鮮，而由副溶血性弧菌導(dǎo)致的食物中毒事件也在國內(nèi)外多地逐年發(fā)生[5-9]，水產(chǎn)食品的安全問題引起各國高度重視。

副溶血性弧菌檢驗是保證水產(chǎn)食品安全中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。我國目前副溶血性弧菌檢驗依照GB 4789.9-2016進行檢驗，整個檢驗流程一般需要5～7個工作日；且在檢驗過程中有很多因素會干擾檢驗結(jié)果，如人員操作、培養(yǎng)基質(zhì)量、檢驗環(huán)境等，排除外在干擾條件確保準確是立足之本，進一步提高時效性則是保證紛繁多樣水產(chǎn)食品安全的重要措施。近年來，耐藥菌株的出現(xiàn)[11,12]更對副溶血性弧菌檢驗的準確性和時效性更是提出了更高的要求[13-19]。而即用型副溶血性弧菌標準物質(zhì)既能排除干擾保證結(jié)果，又能省去培養(yǎng)陽性對照菌株時間從而保證時效性。

我國在即用型微生物標準物質(zhì)研究方面起步較晚[20]，關(guān)于副溶血性弧菌的標準物質(zhì)，目前只有福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心研究含有魚肉基質(zhì)副溶血性弧菌標準物質(zhì)[21]的報道，而不含基質(zhì)的標準物質(zhì)目前還沒有相關(guān)報道，且國外目前尚無副溶血性弧菌的標準物質(zhì)的相關(guān)報道。本研究制備的副溶血性弧菌標準物質(zhì)不含基質(zhì)，可以依據(jù)不同目的添加不同基質(zhì)或直接使用，靈活性更高。彌補了我國在副溶血性弧菌標準物質(zhì)方面的不足。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，V. parahaemolyticus）CMCC20030來源于中國醫(yī)學細菌保藏管理中心（China Medical Bacterial Species Conservation and Management Center，CMCC）。

1.1.2 試劑與儀器

3%氯化鈉堿性蛋白胨水、TCBS培養(yǎng)基為北京陸橋公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptose soya agar，TSA）為美國BD公司產(chǎn)品；生理鹽水、氯化鈉、L型細胞涂布棒（L棒）為國藥集團產(chǎn)品；西林瓶（2 mL）為肖特藥品包裝（浙江）有限公司。Thermo1389生物安全柜為美國Thermo公司產(chǎn)品；Thermo 205050GC恒溫培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品；VITEK COMPACT 2全自動微生物分析系統(tǒng)為產(chǎn)品法國梅里埃公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）為德國Bruker公司產(chǎn)品；LABCONCO FreeZone12L冷凍干燥機為德國LABCONCO公司產(chǎn)品；FORMA恒溫搖床、HYC-940螺旋涂布儀為西班牙IUL公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株確認

用10 μm接種環(huán)，取凍存于-80 ℃凍存液（50%甘油配制的BHI液體培養(yǎng)基）的CMCC20030菌株一環(huán)，分區(qū)劃線于3%氯化鈉TSA平板，置36 ℃培養(yǎng)18～24 h。挑取單菌落分區(qū)劃線于3%氯化鈉TSA平板，置36 ℃培養(yǎng)18～24 h。分別采用質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）、生化方法（VITEK COMPACT 2全自動微生物分析系統(tǒng)）、基因序列（16S RNA）測定3種方法對CMCC20030菌株進行種屬確認。

1.2.2 副溶血性弧菌樣品的制備

用高壓滅菌后的棉簽收集CMCC20030新鮮培養(yǎng)物于凍干保護劑中，渦旋震蕩確保菌液均勻，以20 μL/樣品進行速凍，于冷凍干燥機中進行冷凍干燥，制備樣品。

用1 mL生理鹽水稀釋凍干前菌液20 μL，通過螺旋涂布儀的E50模式涂布于3%氯化鈉TSA平板，置36 ℃培養(yǎng)18～24 h后，計數(shù)活菌數(shù)目作為凍干前樣品CFU數(shù)目。用1 mL生理鹽水溶解樣品，并依照上述方法涂布、培養(yǎng)，統(tǒng)計菌落數(shù)作為凍干后樣品CFU數(shù)目。凍干前樣品CFU數(shù)目/凍干后樣品CFU數(shù)目為凍干存活率。依照凍干存活率調(diào)制菌液，最終制備成103CFU/樣品的副溶血性弧菌菌球800個，將每個樣品分別放入2 mL的西林瓶中，并用冷凍干燥機真空壓蓋，待用。

1.2.3 副溶血性弧菌樣品的均勻性檢驗

隨機抽取副溶血性弧菌樣品20個，依照檢測凍干后樣品CFU數(shù)目的方法，設(shè)置2個平行，統(tǒng)計樣品CFU數(shù)目。通過單因素方差分析方法分析本次研制的副溶血性弧菌樣品的均勻性。

1.2.4 副溶血性弧菌樣品的穩(wěn)定性檢驗

將副溶血性弧菌樣品放置于25、37 ℃環(huán)境中，分別于1、3、5、7 d抽取3個樣品，依照均勻性檢驗方法統(tǒng)計樣品CFU數(shù)目，并以均勻性檢驗樣品的均數(shù)為基數(shù)計算存活率，對運輸穩(wěn)定性進行評價。

將副溶血性弧菌樣品放置于4 ℃、-20 ℃冰箱中，其中4 ℃保存的樣品分別于0、7、14、28 d各抽取3個，-20 ℃保存的樣品分別于14、28、60 d各抽取3個，分別依照均勻性檢驗方法統(tǒng)計CFU數(shù)目，并以均勻性檢驗樣品的均數(shù)為基數(shù)計算存活率，對保藏穩(wěn)定性進行評價。

1.2.5 協(xié)作標定

向5家實驗室分別發(fā)放隨機抽取的10個樣品，并提供作業(yè)指導(dǎo)書。作業(yè)指導(dǎo)書提供方法如下：將每個樣品溶解于1 mL生理鹽水中，使用渦旋振蕩器充分混勻作為原液，取100 μL原液與900 μL生理鹽水混勻，制成1:10稀釋液，分別取上述兩種濃度的稀釋液100 μL，并用L棒或全自動螺旋涂布儀涂布于3%氯化鈉TSA平板，設(shè)置2個平行，將平板置36 ℃培養(yǎng)18～24 h后，統(tǒng)計樣品CFU數(shù)目，并對菌落進行生化鑒定。

1.2.6 副溶血性弧菌菌球食品基質(zhì)驗證

表1 食品基質(zhì)信息表Table 1 Food matrices information

根據(jù)GB 29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》選擇水產(chǎn)制品作為食品基質(zhì)（詳見表1），稱取每種基質(zhì)2份（25 g/份），1份作為驗證基質(zhì)，1份作為本底對照。隨機取3個樣品用3 mL生理鹽水溶解作為待驗證菌液，取100 μL至各個驗證基質(zhì)作為試驗組，另取100 μL生理鹽水至本底作為對照組，隨后依照GB 4789.7-2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗副溶血性弧菌檢驗》進行檢驗。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

各個檢測項目的數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS（Statistical Product and Service Solutions）處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株種屬確認

菌株CMCC20030種屬結(jié)果確認如下：MALDI-TOF MS鑒定為V. parahaemolyticus（分值為2.302），VITEK COMPACT 2全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定為V. parahaemolyticus（99% Probobility），16s RNA基因序列經(jīng)NCBI分析為V. parahaemolyticus（100% Percent Identity）。

2.2 副溶血性弧菌凍干樣品的制備

本研究制備副溶血性弧菌凍干樣品800個。在研制過程中發(fā)現(xiàn)，副溶血性弧菌凍干后存活率較低（0.8‰），這可能也是限制我國副溶血性弧菌標準物質(zhì)發(fā)展的限制因素之一。本研究通過提高副溶血性弧菌母液的濃度以及優(yōu)化凍干條件，如選擇液氮快速塑形（樣品為白色球狀）、真空凍干以及真空壓蓋，已經(jīng)形成了穩(wěn)定的研制方法：制備高濃度（106CFU/mL）副溶血弧菌母液濃度，在液氮中快速塑形成球（20 μL/球）、真空凍干16 h、真空壓蓋、-20 ℃保存樣品。

2.3 副溶血性弧菌凍干樣品的均勻性檢驗

表2 副溶血性弧菌樣品均勻性計數(shù)結(jié)果Table 2 Results of uniform count ofV. parahaemolyticussamples (103 CFU/sample)

表3 副溶血性弧菌樣品運輸穩(wěn)定性計數(shù)結(jié)果Table 3 Counting results of transport stability ofV. parahaemolyticus samples (103 CFU/sample)

表4 副溶血性弧菌樣品儲藏穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 4 Counting results of preservation stability ofV. parahaemolyticus samples (103 CFU/sample)

隨機抽取的20個副溶血性弧菌凍干樣品計數(shù)結(jié)果見表2。經(jīng)分析，數(shù)值分布符合正態(tài)分布，最大值為2490 CFU/樣品，最小值為1950 CFU/樣品，中位數(shù)為2320 CFU/樣品，均值為2286 CFU/樣品，樣品間標準差約為330 CFU。經(jīng)單因素方差分析，樣品滿足均勻性檢驗要求（F=1.92，p＞0.05）。從均勻性檢驗結(jié)果結(jié)果看出，拿到樣品后，用1 mL生理鹽水溶解本樣品即可得到103CFU/mL的菌溶液（微生物檢驗適于定性、定量的工作液），省去稀釋等過程。

2.4 副溶血性弧菌樣品的穩(wěn)定性檢驗

副溶血性弧菌樣品運輸穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表3。從結(jié)果可以看出，在37 ℃存放3 d或25 ℃存放7 d后樣品活菌數(shù)目仍滿足研制前設(shè)定的103CFU/菌球要求。

副溶血性弧菌樣品保藏穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表4。從結(jié)果可以看出，-20 ℃保藏60 d或4 ℃保藏28 d后樣品活菌數(shù)目仍滿足研制前設(shè)定的103CFU/菌球要求，即-20 ℃可以作為長期存放條件，且經(jīng)過后期繼續(xù)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)-20 ℃保藏3年后仍為103CFU/菌球。而4 ℃可以作為短期儲存條件。

在穩(wěn)定性檢驗中，發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌標準物質(zhì)在37 ℃存放3 d內(nèi)，樣品滿足103CFU/菌球要求，而我國運輸系統(tǒng)較為發(fā)達，樣品寄送時間大約2～3 d，因此滿足運輸穩(wěn)定性要求。若在郵寄時添加冰袋或干冰，則穩(wěn)定性會進一步加強。如何提高副溶血性弧菌標準物質(zhì)在37 ℃等高溫條件下的穩(wěn)定性是未來研究的方向。

2.5 副溶血性弧菌樣品的協(xié)同標定

為保證研制的副溶血性弧菌樣品數(shù)據(jù)準確可靠，本實驗室組織了5家實驗室開展協(xié)作標定實驗。標定結(jié)果顯示，生化鑒定均為副溶血性弧菌，具體活菌含量結(jié)果見表5。從結(jié)果可以看出，5家實驗室檢測樣品活菌含量均在103CFU/樣品的水平，滿足研制前設(shè)計含量為103CFU/樣品的要求。

表5 5家實驗室協(xié)作標定結(jié)果(103 CFU/樣品)Table 5 Collaborative calibration results of 5 laboratories

本實驗室關(guān)于副溶血性弧菌標準物質(zhì)計數(shù)的方法均是螺旋涂布方法。如在均勻性檢驗中，各個樣品活菌含量數(shù)值高度一致，樣品間誤差小。而在組織協(xié)同標定的實驗中，有些實驗室選擇手工L棒涂布的方法，雖然結(jié)果都滿足103CFU/樣品要求，但是樣品間差異大于螺旋涂布的方法?？赡茉蚴窃诼菪坎紩r，僅有涂布針孔接觸樣品溶液以及培養(yǎng)基，且針孔涂布路徑一致。而L棒涂布時，接觸培養(yǎng)基的面積遠大于涂布針孔；且涂布路徑不能保證高度一致，另外在涂布完成后沾留在L棒上的菌液也存在差異，以上因素均可能導(dǎo)致偏差?，F(xiàn)在國內(nèi)外不少定量研究均是采取螺旋涂布接種方法[22,23]。

2.6 副溶血性弧菌樣品的食品基質(zhì)驗證

在食品基質(zhì)驗證實驗中，試驗組均檢測出副溶血性弧菌，結(jié)果見表1；對照組均未檢測出副溶血性弧菌。

為保證副溶血性弧菌樣品具有廣泛的應(yīng)用范圍，本研究根據(jù)GB 29921-2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》選擇20種水產(chǎn)制品作為食品基質(zhì)做驗證試驗。通過結(jié)果可以看出，本研究副溶血性弧菌標準物質(zhì)可以直接作為對照適用于多種水產(chǎn)質(zhì)品副溶血性弧菌檢驗中的陽性對照，省去接種、培養(yǎng)陽性對照菌株的時間，簡化檢驗程序，提高檢驗效率。

3 結(jié)論

本研究研制的副溶血性弧菌標準物質(zhì)均一性、穩(wěn)定性以及基質(zhì)驗證均符合預(yù)期設(shè)定，滿足相關(guān)要求，已被納入國家藥品標準物質(zhì)（編號800006）。副溶血性弧菌標準物質(zhì)不僅可以用于加強對食品副溶血性弧菌檢驗的質(zhì)量控制，還可以用于實驗室內(nèi)部培養(yǎng)基質(zhì)量、陽性對照、方法確認、人員考核、檢驗環(huán)境等各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，而且本研究制備的副溶血性弧菌標準物質(zhì)不含基質(zhì)，可以依據(jù)不同目的添加不同基質(zhì)或直接使用，靈活性更高，為今后準確無誤的副溶血性弧菌檢驗提供基礎(chǔ)支持，更是彌補了我國在副溶血性弧菌標準物質(zhì)方面的不足。