張立釗，張娟，蔣軒，陳力力，盧昌麗

（1.廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院,廣東廣州 510670）

（2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410128）

（3.食品科技和生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙 410128）

木糖作為木聚糖的一個(gè)組分（木聚糖中85%～96% 是木糖），在自然界以多糖的形態(tài)廣泛存在于植物纖維中[1-3]。對(duì)植物纖維進(jìn)行預(yù)處理制得木糖提取液，再通 過(guò)微生物發(fā)酵可制得可再生清潔燃料—乙醇[4-8]，對(duì)于緩解當(dāng)今世界面臨的能源、環(huán)境問(wèn)題具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。酵母菌是糖類發(fā)酵產(chǎn)乙醇的重要菌種之一，目前，利用己糖轉(zhuǎn)化為乙醇的工藝已經(jīng)成熟，而能利用木糖作為碳源生長(zhǎng)繁殖的酵母大多不能發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇或者乙醇產(chǎn)率也較低，目前報(bào)道已知的酵母菌種中發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量最高僅10.4 g/L，因此選育能利用木糖并能高產(chǎn)乙醇的酵母菌是決定植物纖維資源生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵因素之一[9-13]，有待進(jìn)一步研究。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變育種是在室溫常壓條件下，用高純氦氣（He）產(chǎn)生的大量等離子體流，作用于微生物細(xì)胞，使其細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及通透性改變，并引起遺傳物質(zhì)DNA損傷而產(chǎn)生大量突變株，從中篩選獲得目標(biāo)菌株的菌種選育方法。該方法與傳統(tǒng)誘變方法相比，能夠有效造成DNA多樣性的損傷，突變率高，并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株；與分子操作手段相比，具有操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)有毒有害物質(zhì)參與誘變過(guò)程等優(yōu)點(diǎn)。目前，此育種方法已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、放線菌、真菌、酵母等各種微生物的育種工作中[14-19]。

本研究將從植物原料中自然分離鑒定得到的一株能利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的異常威克漢姆酵母采用ARTP誘變育種技術(shù)，以乙醇產(chǎn)量為考察指標(biāo)，從中選育具有優(yōu)良性能的高產(chǎn)乙醇突變菌株。并以油茶籽殼木糖提取液為主要原料進(jìn)行乙醇發(fā)酵，以此評(píng)價(jià)選育菌株的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用水果均購(gòu)至湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東之源超市濱湖店，蘋(píng)果為嘎啦75#蘋(píng)果，從中分離出來(lái)的酵母菌菌株分別編號(hào)首字母為A。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

木糖、紅四氮唑（RT）等上海瑞永生物科技有限公司；Plant Genomic DNA Kit試劑盒、凝膠回收試劑盒北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；油茶籽殼木糖提取液由實(shí)驗(yàn)室自制[20]。

木糖富集培養(yǎng)基：木糖300 g/L、氯化鈉2 g/L；木糖篩選培養(yǎng)基：木糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、瓊脂20 g/L；種子液培養(yǎng)基：木糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L；混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖+葡萄糖50 g/L、硫酸銨10 g/L、酵母粉2 g/L、硫酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1 g/L，pH自然；TTC下層培養(yǎng)基：木糖10 g/L、酵母粉1.5 g/L、蛋白胨2 g/L、硫酸鎂0.4 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、瓊脂30 g/L、pH 5.5～5.7；TTC上層培養(yǎng)基：紅四氮唑（RT）0.5 g/L、木糖0.5 g/L、瓊脂1.5 g/L；油茶籽殼發(fā)酵培養(yǎng)基：油茶籽殼木糖提取液、葡萄糖35.05 g/L、硫酸銨10 g/L、酵母粉2 g/L、硫酸二氫鉀2 g/L、硫酸鎂1 g/L，pH自然。所有培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，備用。

1.3 儀器與設(shè)備

752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；7890B氣相色譜儀，Merck Millipore；DB-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），Agilent；ZWY-240恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；SPX-250BIIIS生化培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；ARTP-ⅡS誘變育種儀，無(wú)錫源清天木生物技術(shù)有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 分離與篩選

分別稱取剪碎的（約1 cm×1 cm）蘋(píng)果果皮制備樣品懸液，接種到木糖富集培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，隨后將培養(yǎng)液涂布木糖篩選培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，挑取酵母菌狀單菌落制備種子液，接種混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基，于28 ℃，100 r/min振蕩發(fā)酵培養(yǎng)60 h，采用氣相色譜法[21]測(cè)定各菌株發(fā)酵液乙醇含量，篩選出產(chǎn)乙醇菌株。

1.4.2 菌株鑒定

YPD培養(yǎng)基接種培養(yǎng)觀察篩選菌株的菌落形態(tài)，美蘭染色光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征，對(duì)其進(jìn)行初步分類；提取菌株基因組DNA，以引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）[22]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Sanger測(cè)序法，根據(jù)PCR產(chǎn)物大小判斷單向或雙向測(cè)序。通過(guò)GenBank網(wǎng)站的BLAST程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的酵母菌ITS序列進(jìn)行同源性比較分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4.3 ARTP誘變處理

將上述分離菌株在28 ℃，160 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)20 h，取培養(yǎng)液5 mL 4000 r/min離心3 min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌泥（離心沉淀物）3次，重懸菌泥于含5%甘油的無(wú)菌生理鹽水中，制備菌懸液。以誘變處理時(shí)間（30、60、90、120、150 s，）為自變量，進(jìn)行誘變處理，誘變處理基本條件為取菌懸液（108個(gè)/mL）10 μL分別均勻涂于載片，將載片放到ARTP誘變育種儀對(duì)應(yīng)孔位，在載片距等離子體放射源2 mm、處理功率為120 W、誘變儀的工作氣體為氦氣，其氣流量10 SLM，產(chǎn)生的等離子體溫度在25～35 ℃條件下，誘變處理適當(dāng)時(shí)間。誘變處理后，將附著在載片上的菌體洗脫制備誘變樣品懸液，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法于木糖篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)算致死率，制作致死率曲線。挑取致死率80%以上的培養(yǎng)平板中的菌落作為突變菌株，備用。

1.4.4 突變菌株的篩選

將上述突變菌株涂布接種于木糖篩選培養(yǎng)基平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落分別接種至加有杜式小管的混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管中（同時(shí)接種出發(fā)菌株作為對(duì)照），28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察杜氏小管中的產(chǎn)氣情況，選取產(chǎn)氣較多的正突變菌株及出發(fā)菌株分別點(diǎn)種到TTC下層培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出單菌落后在其上面倒入TTC上層培養(yǎng)基，陰暗處28 ℃恒溫培養(yǎng)2 h，觀察平板內(nèi)各個(gè)菌落的顏色，計(jì)算突變菌株的正突變率；篩選出顏色較紅的菌落采用1.3.1的方法發(fā)酵培養(yǎng)，取樣分析各菌株乙醇產(chǎn)生情況，篩選出乙醇產(chǎn)量較高的優(yōu)良突變菌株，并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。

1.4.5 利用油茶籽殼木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇試驗(yàn)

參考1.4.1的發(fā)酵條件，將高產(chǎn)乙醇突變菌株在油茶籽殼發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵60 h，采用氣相色譜法測(cè)定乙醇含量，分析菌株乙醇產(chǎn)生情況，并參考文獻(xiàn)[23]方法測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖、木糖的殘?zhí)呛?，?jì)算糖利用率及糖轉(zhuǎn)化率。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2018繪圖，IBM SPSS Statistics 25數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母菌分離與篩選結(jié)果

表1 酵母菌株發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量Table 1 Ethanol production by yeast strains

從樣品中共分離得到126株能利用木糖作為唯一碳源生長(zhǎng)的疑似酵母菌株，編號(hào)為A1-A126，采用混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行乙醇發(fā)酵，篩選出菌株A25、A42、A64、A70、A95，其乙醇產(chǎn)量相對(duì)較高，乙醇含量范圍在8.06～11.93 g/L，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

2.2 菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征鑒定結(jié)果

菌落形態(tài)結(jié)果如圖1所示，A25菌落為白色略帶紅色，不透明；菌落形態(tài)為圓形，表面干燥，粗糙，有部分不規(guī)則的凸起。A42、A64、A70、A95菌落為淡紅色，不透明；菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，表面較干燥，較粗糙。

從上述5個(gè)菌落挑取少量菌體涂片鏡檢結(jié)果如圖2所示。A25菌株呈檸檬狀近橢圓。A42、A64、A70以及A95菌株呈卵圓形，均單個(gè)菌體分散排列。形態(tài)特征結(jié)果可初步鑒定分離得到的5個(gè)利用木糖產(chǎn)乙醇的菌株均為酵母菌。

圖1 酵母菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of yeast

圖2 酵母菌菌體形態(tài)Fig.2 Yeast cell morphology

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜如圖3所示，各菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳條帶均在長(zhǎng)度介于500～750 bp之間，都有較大且明亮的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，條帶均單一且清晰，無(wú)彌散及拖尾現(xiàn)象，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象出現(xiàn)，表明PCR擴(kuò)增結(jié)果符合后續(xù)試驗(yàn)要求。測(cè)序獲得的ITS基因序列與GenBank中收錄的基因序列進(jìn)行同源性比較，并將典型菌株的ITS序列提交Gen Bank，用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖4、圖5。

圖3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram of PCR products

圖4 A25酵母菌的5.8S rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 5.8S rDNA its gene sequence of yeast A25

圖5 A42、A64、A70、A95酵母菌的5.8S rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of 5.8S rDNA its gene sequence of yeast A42, A64, A70 and A95

根據(jù)菌株的形態(tài)特征，結(jié)合ITS基因序列進(jìn)行菌株鑒定，這5株真菌分別屬于畢赤酵母屬（Pichia Hansen）（1/5）的季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii，A25）；漢遜酵母屬（Hansenula H.et P.Sydow）（4/5）的 異 常 威 克 漢 姆 酵 母（Wickerhamomyces anomalus，A42）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus，A64）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus，A70）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus，A95）。

研究表明漢遜酵母屬（Hansenula H.et P.Sydow）中的異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中有過(guò)相關(guān)報(bào)道。劉建利[24]將從各省收集的18個(gè)面引子樣品基于宏基因組采用PCR擴(kuò)增ITS1區(qū)，Illumina Miseq測(cè)序，云平臺(tái)分析樣品中酵母菌群落，結(jié)果表明樣品中共有12個(gè)屬、16種酵母菌，其中上述菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。竇曉等[25]對(duì)不同時(shí)期大曲中分離的酵母菌采用26S rRNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行分析比對(duì)，共分離鑒定了260株酵母菌，分屬于22個(gè)種，其中異常威克漢姆酵母101株，為主要的優(yōu)勢(shì)菌種。上述報(bào)道證明該菌株在食品應(yīng)用中的可行性。另外，該屬的酵母菌也有利用木糖發(fā)酵的能力，陳啟順[26]對(duì)四川八個(gè)地區(qū)家白酒廠的酒醅進(jìn)行代謝木糖真核微生物分離純化，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定104株真核微生物中有4株漢遜酵母屬（Hansenula H.et P.Sydow），但該屬的酵母菌是否能利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇，并未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。

異常威克漢姆酵母發(fā)酵時(shí)還能產(chǎn)生多種揮發(fā)性香氣物質(zhì)，葉萌祺等[27]通過(guò)產(chǎn)酯試驗(yàn)對(duì)從果庫(kù)空氣樣品和3個(gè)品種蘋(píng)果樣品中分離純化得到6株產(chǎn)香性能較好的酵母菌。通過(guò)蘋(píng)果酒發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中一株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）YN6的產(chǎn)酯能力最強(qiáng)。GC-MS測(cè)定結(jié)果表明，接種YN6后能產(chǎn)生丙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸-2-甲基丙基酯、乙酸異丁酯、乙酸丁酯和壬醛等特有物質(zhì)。上述菌種的報(bào)道均通過(guò)己糖發(fā)酵，而本文得到的該菌株具有利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力。

2.3 誘變處理時(shí)間對(duì)突變菌株致死率影響

誘變處理時(shí)間對(duì)突變菌株的突變率影響非常大，時(shí)間過(guò)短則蛋白質(zhì)或DNA損傷較小，細(xì)胞在進(jìn)行修復(fù)的過(guò)程中不足以發(fā)生突變，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致突變菌株全部死亡或者存活的數(shù)量過(guò)少。選擇上述乙醇產(chǎn)量最高的異常威克漢姆酵母A42作為出發(fā)菌株，其在ARTP不同誘變處理時(shí)間后得到的致死率曲線見(jiàn)圖6。誘變處理時(shí)間對(duì)致死率的影響分為三個(gè)階段，在誘變處理時(shí)間為30 s到60 s范圍內(nèi)致死率快速升高，從13.33%升高到53.33%，誘變處理時(shí)間從60 s到120 s范圍內(nèi)，致死率繼續(xù)升高，120 s時(shí)達(dá)到97.53%，誘變處理時(shí)間從120 s到150 s范圍內(nèi)致死率緩慢升高，直至菌體全部死亡。因此選擇誘變處理時(shí)間為120 s能保證致死率在80%以上且有一定數(shù)量的菌株存活，因此將其作為后續(xù)試驗(yàn)的誘變條件。

該致死率曲線與沈飛翔等[28]報(bào)道的用ARTP誘變方法作用于產(chǎn)γ-聚谷氨酸枯草芽孢桿菌的致死率曲線較為相似，在誘變處理時(shí)間為30 s時(shí)致死率達(dá)到80%，120 s時(shí)可達(dá)到90%以上。賈嬋媛等[29]采用紫外誘變方法對(duì)產(chǎn)木糖醇的熱帶假絲酵母JS-3進(jìn)行不同輻射時(shí)間下的處理，發(fā)現(xiàn)8 min時(shí)菌株致死率達(dá)到78%，12 min才達(dá)到96%。以上說(shuō)明ARTP誘變方法產(chǎn)生的高濃度活性粒子對(duì)微生物具有較強(qiáng)的破壞力。另外，各種微生物均應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)奶幚矸椒?，才能達(dá)到最佳的誘變效果。

圖6 異常威克漢姆酵母A42在ARTP不同誘變處理時(shí)間后的致死率曲線Fig.6 Lethality curve ofWickerhamomyces anomalus A42 after different time of ARTP mutation

乙醇的工業(yè)生產(chǎn)常采用釀酒酵母或卡爾酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵，這些菌種均只能利用葡萄糖等己糖作為碳源而不能利用木糖等戊糖。研究表明，假絲酵母能發(fā)酵D-木糖異構(gòu)化代謝物D-木酮糖生產(chǎn)乙醇[30]，但其發(fā)酵產(chǎn)乙醇能力有限。另有研究表明[31,32]在云南采集的腐木樣品中用木糖分離培養(yǎng)基、木聚糖分離培養(yǎng)基、纖維二糖分離培養(yǎng)基分離出了3株產(chǎn)乙醇的新酵母菌菌種Clavisporasp.NYNU 161120T、Clavisporasp.NYNU 174173T、Scheffersomycessp.NYNU 17926T，其中乙醇產(chǎn)量最高的為Clavisporasp.NYNU 161120T，其發(fā)酵20 h乙醇含量最高達(dá)到10.40±0.02 g/L。由此可見(jiàn)本試驗(yàn)篩得的酵母菌利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力相對(duì)較高，可將其作為作為親本菌株通過(guò)誘變育種技術(shù)進(jìn)一步提高乙醇產(chǎn)量。

近年來(lái)逐漸興起以等離子體作為新型物理誘變?cè)吹腁RTP誘變育種，ARTP對(duì)微生物的作用主要為高濃度的中性活性粒子，用ARTP處理后的細(xì)胞，其膜通透性增強(qiáng)，在細(xì)胞基質(zhì)中產(chǎn)生ROS并進(jìn)入細(xì)胞核，從而與細(xì)胞中的生物大分子發(fā)生作用，如與DNA作用發(fā)生DNA的鏈間交聯(lián)或烷基化或者與蛋白質(zhì)作用形成超氧化物，從而改變細(xì)胞的遺傳特性和代謝活性[33-36]。利用ARTP技術(shù)對(duì)酵母菌進(jìn)行誘變育種相較于其他育種方法具有鮮明的優(yōu)勢(shì)，研究表明用兩種物理誘變方法對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，CCIC-1517RM）進(jìn)行紫外線和γ射線的復(fù)合誘變，得到誘變菌株LH4，通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化后最終乙醇濃度僅0.55 g/L[37]。張?chǎng)析蔚萚38]將Spathaspora passalidarumNRRL Y-27907進(jìn)行紫外誘變，再通過(guò)其與釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeF3（通過(guò)基因組重排技術(shù)獲得的耐高溫釀酒酵母）進(jìn)行原生質(zhì)體融合實(shí)驗(yàn)，得到融合子UF44，其發(fā)酵最高乙醇含量為16.45 g/L。由此可以證實(shí)相較于傳統(tǒng)的育種方法ARTP誘變?cè)诮湍妇T變育種上的優(yōu)越性，該方法能更大限度的提升酵母菌發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力。

另有報(bào)道稱采用ARTP誘變育種儀對(duì)兩株釀酒酵母菌株分別進(jìn)行誘變。突變酵母菌株發(fā)酵的啤酒中嘌呤含量相比初始菌株分別降低了23.6%和21.3%。對(duì)兩株突變菌株進(jìn)行連續(xù)傳代10次并進(jìn)行發(fā)酵啤酒實(shí)驗(yàn)，其發(fā)酵性能、發(fā)酵啤酒中總嘌呤含量和啤酒品質(zhì)均保持穩(wěn)定[39]。由此可見(jiàn)ARTP誘變育種方法在酵母菌誘變育種中的有效性。

2.4 突變菌株初篩

在進(jìn)行酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，菌株產(chǎn)氣的時(shí)間越早、產(chǎn)氣量越多，則代表菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇的性能越好。為此，本研究以杜氏管發(fā)酵法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，半定量分析突變菌株的產(chǎn)氣量。挑選的500株A42突變菌株中杜氏小管充滿氣體的236株；充滿2/3氣體的48株；充滿1/3氣體的84株；少于1/3氣體或沒(méi)有氣體132株，親本菌株為充滿2/3氣體。

圖7 TTC比色法初篩A42突變菌株部分結(jié)果Fig.7 Partial results of screening A42 mutant by TTC colorimetry

TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）是一種能與酵母菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應(yīng)的顯色劑，通過(guò)顏色可以判斷酵母呼吸酶活力的大小，間接反映酵母產(chǎn)乙醇能力的高低。在培養(yǎng)的酵母菌落上傾倒一層TTC顯色劑，菌落則會(huì)顯示深淺不一的紅色，產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)的酵母會(huì)顯現(xiàn)深紅色，再者為粉紅色、微紅色甚至不顯色突變菌株的紅色深度越深，乙醇產(chǎn)量可能就越高，說(shuō)明該突變菌株在ARTP誘變中發(fā)生的正突變效應(yīng)越大。如圖7所示為產(chǎn)氣量比親本菌株多的236個(gè)突變菌株中部分顯色反應(yīng)結(jié)果及與出發(fā)菌株的對(duì)比。以菌落反應(yīng)后顯現(xiàn)出來(lái)的紅色深度為考察標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，其結(jié)果表明36株為深紅色，177株為粉紅色，23株為微紅色或不顯色，親本菌株A42為微紅色。

本試驗(yàn)將紅色深度比親本菌株多的突變菌株視為發(fā)生了正突變效應(yīng)的突變菌株，計(jì)算得正突變率為42.60%。選擇36個(gè)正突變菌株進(jìn)行下一輪的復(fù)篩。

2.5 突變菌株復(fù)篩

采用氣相色譜法測(cè)定各菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇含量，對(duì)比分析結(jié)果見(jiàn)表2，少數(shù)菌株的乙醇產(chǎn)量低于出發(fā)菌株。由此可以看出復(fù)篩的必要性，因?yàn)橐援a(chǎn)氣量和呼吸酶活力為指標(biāo)的篩選僅能初步確定正突變菌株，結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物乙醇含量測(cè)定才能正確篩選出ARTP誘變發(fā)生正突變效應(yīng)的菌株。突變菌株中乙醇產(chǎn)量最高的菌株為異常威克漢姆酵母A42-338，其乙醇產(chǎn)量較親本菌株提高了42.59%，含量為20.78 g/L。

表2 A42突變菌株復(fù)篩的乙醇產(chǎn)量Table 2 Ethanol production of A42 mutants screened again

2.6 優(yōu)良菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

突變菌株的遺傳穩(wěn)定性對(duì)于該菌株在實(shí)際工業(yè)中的應(yīng)用具有極其重要的意義，因此對(duì)篩選出的突變菌株A42-338傳代培養(yǎng)8次，通過(guò)測(cè)定突變菌株的各代發(fā)酵液中的乙醇含量考察其遺傳穩(wěn)定性。由圖8可知，A42-338經(jīng)過(guò)8次代傳乙醇產(chǎn)量在20.41～20.84 g/L之間，波動(dòng)范圍在2.50%以內(nèi)，表明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，是一株具有很大工業(yè)應(yīng)用前景的乙醇生產(chǎn)菌，可作為后續(xù)用于應(yīng)用研究的酵母菌突變菌株。

圖8 各菌株傳代培養(yǎng)后各代乙醇產(chǎn)量Fig.8 Ethanol content of each strain after subculture

2.7 優(yōu)良菌株發(fā)酵油茶籽殼木糖產(chǎn)乙醇

研究表明，油茶籽殼發(fā)酵培養(yǎng)基中木糖含量為11.63 g/L，葡萄糖含量為38.87 g/L。按1.4.1中的發(fā)酵條件，將異常威克漢姆酵母A42-338在油茶籽殼發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵60 h后，乙醇含量為19.88 g/L，還原糖殘?zhí)呛繛?.06 g/L，其中木糖殘?zhí)呛繛?.79 g/L，葡萄糖殘?zhí)呛繛?.27 g/L，木糖利用率為84.61%，葡萄糖利用率為81.05%，糖轉(zhuǎn)化率為0.40 g乙醇/g糖。由此證明該突變菌株是一株具有應(yīng)用價(jià)值的利用木糖高產(chǎn)乙醇的酵母菌。

3 結(jié)論

ARTP誘變是一種高效可行的酵母菌育種方法，將分離得到Wickerhamomyces anomalusA42進(jìn)行ARTP誘變處理120 s，此時(shí)致死率達(dá)到97.53%，在高致死率下且有一定數(shù)量存活的菌株，是誘變育種的較佳條件，其乙醇產(chǎn)量較親本菌株提高了42.59%，達(dá)到20.78 g/L，且傳代8次各代乙醇產(chǎn)量變化率不超過(guò)2.5%。通過(guò)Wickerhamomyces anomalusA42-338對(duì)油茶籽殼木糖提取液的發(fā)酵，有望開(kāi)發(fā)出具有特殊風(fēng)味的酒精飲料等新產(chǎn)品，提升農(nóng)產(chǎn)品的附加值以及利用率。后續(xù)研究可繼續(xù)針對(duì)Wickerhamomyces anomalusA42-338進(jìn)行發(fā)酵油茶籽殼的條件優(yōu)化，以提高油茶籽殼的利用率。