賀海峰，華 鵬,崔 翔

(1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院脾胃病二科,陜西 西安 720082 2.陜西省安康市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 安康 725000)

膿毒癥是嚴(yán)重?zé)齻⑿菘撕屯饪剖中g(shù)后等患者常會(huì)出現(xiàn)的并發(fā)癥，可由細(xì)菌引起。膿毒癥可導(dǎo)致腸道功能損傷，進(jìn)而引發(fā)內(nèi)毒素移位，加重器官功能障礙，形成惡性循環(huán)[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要活性成分，在引發(fā)例如膿毒癥這種全身炎癥反應(yīng)中起著重要作用[2]。因此，研究?jī)?nèi)毒素性腸損傷機(jī)制及其治療措施，對(duì)于防治內(nèi)毒素性器官功能障礙具有重要意義。細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞非典型死亡方式，與細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑和死亡方式不同，它可通過炎性信號(hào)通路的Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)，切割消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、促炎因子白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-1β和IL-18并釋放，細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng)并膨脹破裂死亡[3]。大黃牡丹湯具有瀉熱消腫、破結(jié)散結(jié)的功效，可治療急性盆腔炎等濕熱瘀結(jié)類病癥[4]。目前關(guān)于大黃牡丹湯對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞焦亡以及NLRP3/caspase-1炎性信號(hào)通路的影響鮮有報(bào)道，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)大黃牡丹湯對(duì)腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為預(yù)防和治療內(nèi)毒素性腸損傷提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材 料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：32只250g～270g SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物資格證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004。實(shí)驗(yàn)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，室溫為20～25℃，相對(duì)濕度為50%～60%，通風(fēng)良好。大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循3R原則給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道的關(guān)懷照顧。

1.1.2主要試劑：大黃牡丹湯處方：3g牡丹皮、9g芒硝、9g桃仁、12g大黃、30g冬瓜仁。用6L蒸餾水煎煮，濃縮至1L時(shí)過濾去渣，加入芒硝再次煮沸，靜置冷卻后過濾取上清，藥劑使用前加蒸餾水稀釋至所需濃度。大鼠腸上皮細(xì)胞(貨號(hào)：LHY3015)；脂多糖(貨號(hào)：L6386)；DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM，貨號(hào)：C11960500BT )；噻唑藍(lán)(thiazolyl blue,MTT，貨號(hào)：PB180519)、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO，貨號(hào):133050)和0.25%胰蛋白酶溶液(貨號(hào):PB180223)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、蛋白提取試劑盒和蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；熒光二抗和熒光染料DAPI購(gòu)自美國(guó)Life公司；IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、IL-18 ELISA試劑盒、NLRP3抗體、caspase-1抗體和GSDMD-C抗體購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.1.3儀器：生物安全柜購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Forma公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；Facscalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；垂直板電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像系統(tǒng)、酶標(biāo)儀購(gòu)自Bio-Rad公司，等。

1.2方 法

1.2.1將32只大鼠隨機(jī)分為4組：空白組和大黃牡丹湯低、中、高劑量組，每組8只，用藥劑量按照動(dòng)物體表面積比率換算等劑量法，大黃牡丹湯低、中、高劑量組大鼠分別以2.52、5.04、7.56g/kg灌胃給藥，空白組大鼠給予蒸餾水灌胃，灌胃10mL/kg，1次/d、連續(xù)7d。最后1次給藥6h后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈穿刺取血，離心取上清并除菌滅活，儲(chǔ)于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞分組及培養(yǎng):將腸上皮細(xì)胞隨機(jī)分為5組，每組各設(shè)置10個(gè)平行對(duì)照：對(duì)照組：給予腸上皮細(xì)胞空白血清培養(yǎng)12h；LPS組：向腸上皮細(xì)胞中加入LPS(最終濃度為50mg/mL[5])和空白血清，培養(yǎng)12h；大黃牡丹湯低、中、高劑量組：向腸上皮細(xì)胞中加入LPS和大黃牡丹湯含藥血清，培養(yǎng)12h。

1.2.3MTT法檢測(cè)腸上皮細(xì)胞活性:將腸上皮細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，按照1.2.2中的分組進(jìn)行處理。每孔加入20μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4h后，離心，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL DMSO，避光并混勻，通過酶標(biāo)儀測(cè)定每孔細(xì)胞的570nm吸光度(A)值。細(xì)胞活性(%)=(A1～5-A空白組)/(A1-A空白組)×100%，A空白組為150μL細(xì)胞培養(yǎng)基于570nm A值，用以排除本底A值對(duì)結(jié)果的影響。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞凋亡情況：將腸上皮細(xì)胞配制為1×106個(gè)/mL密度的單細(xì)胞懸液，2mL/孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按照1.2.2中的分組培養(yǎng)細(xì)胞，棄去上層培養(yǎng)基并加入胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，加入新的培養(yǎng)基終止消化后，離心收集細(xì)胞，無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗滌細(xì)胞2次，隨后用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒中的緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL。取各組100 μL重懸后的細(xì)胞分別加入流式管中，再向流式管中加入5 μL Annexin V-FITC抗體和5μL Annexin V-PI抗體，快速混勻后避光孵育15min，加入400μL緩沖液混勻后流式細(xì)胞儀中分析細(xì)胞凋亡情況，注意全程冰上操作。

1.2.5蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)(Western-blot,WB)檢測(cè)NLRP3、caspase-1和GSDMD-C的表達(dá)水平：將腸上皮細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，按照2.2中的分組進(jìn)行處理。棄去培養(yǎng)基后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止后離心，無菌PBS洗滌細(xì)胞2次，再次離心棄上清，加入細(xì)胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后取50g進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏(二)氟乙烯(Polyvinylidene difluoride,PVDF)膜上，在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，加入稀釋(1∶1000)的對(duì)應(yīng)一抗，4 ℃搖床孵育過夜，棄去一抗溶液并洗滌PVDF膜，加入稀釋(1∶2000)的二抗溶液，室溫?fù)u床1 h，洗膜3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑(Enhanced chemilum inescence,ECL)顯色并用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.6免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3的表達(dá):配制2×105個(gè)/mL密度的腸上皮細(xì)胞，2mL接種于24孔板中培養(yǎng)過夜，按照2.2中的分組進(jìn)行處理。棄培養(yǎng)基后進(jìn)行細(xì)胞固定，PBS洗滌3次，用5%牛血清白蛋白室溫封閉1h，加入NLRP3抗體過夜，PBS洗滌后加入熒光二抗，室溫孵育2h，洗滌后加入熒光染料DAPI孵育3min，PBS洗滌3次，封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18的含量:在96孔ELISA板中4℃過夜包被IL-1β抗體，棄去后用含吐溫-20的PBS洗板3次，加入5%脫脂奶室溫封閉1h。棄去封閉液后加入各組細(xì)胞上清液，室溫孵育2h后洗板3次，加入100μL/孔的檢測(cè)抗體，室溫孵育1h后洗板3次，加入100μL/孔的二抗溶液，室溫孵育30min后洗板5次，100μL/孔顯色液孵育15min，加入50μL/孔終止液終止反應(yīng)，測(cè)定每孔450nm處的吸光度值。

2 結(jié) 果

2.1大黃牡丹湯對(duì)LPS損傷腸上皮細(xì)胞活性、及凋亡率的影響:與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞活性顯著降低(P<0.05)；與LPS組相比，大黃牡丹湯各組的細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05)，各組細(xì)胞活性數(shù)據(jù)如表1所示。LPS組細(xì)胞凋亡率相比于對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；大黃牡丹湯各組細(xì)胞凋亡率相比于LPS組顯著降低(P<0.05)，結(jié)果如表1、圖1所示。

圖1 大黃牡丹湯對(duì)LPS誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

表1 大黃牡丹湯對(duì)LPS損傷腸上皮細(xì)胞活性及凋亡率的影響

2.2大黃牡丹湯對(duì)LPS損傷腸上皮細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平的影響：與對(duì)照組相比，LPS組NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；與LPS組相比，大黃牡丹湯各組細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)，如表2、圖2所示。免疫熒光結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞的NLRP3熒光強(qiáng)度相較于對(duì)照組顯著增強(qiáng)(P<0.05)，大黃牡丹湯各組細(xì)胞的NLRP3熒光強(qiáng)度相較于LPS組顯著降低(P<0.05)，見表2、圖3。

圖2 大黃牡丹湯對(duì)LPS損傷腸上皮細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平的影響

圖3 大黃牡丹湯對(duì)LPS損傷腸上皮細(xì)胞NLRP3蛋白熒光強(qiáng)度的影響

表2 大黃牡丹湯對(duì)LPS損傷腸上皮細(xì)胞NLRP3 caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)水平的影響

2.3大黃牡丹湯對(duì)LPS損傷腸上皮細(xì)胞IL-1β和IL-18含量的影響:與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18含量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，大黃牡丹湯各組細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18含量顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 大黃牡丹湯對(duì)LPS損傷腸上皮細(xì)胞IL-1β和IL-18含量的影響

3 討 論

革蘭氏陰性細(xì)菌感染可引起膿毒癥，該癥病情兇險(xiǎn)，可導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)和器官功能障礙[6]。膿毒癥引起功能障礙的始發(fā)器官為腸道，細(xì)菌內(nèi)毒素主要活性成分脂多糖可導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞屏障功能喪失，不僅破壞腸道功能還可引發(fā)全身免疫系統(tǒng)激活，促進(jìn)慢性病毒感染和代謝性疾病的發(fā)展[7]。因此，尋找安全有效的藥物和治療方法保護(hù)腸上皮細(xì)胞，對(duì)于減輕膿毒癥癥狀非常重要。

Hersoug[8]等研究報(bào)道，腸道微生物群的脂多糖可刺激脂肪細(xì)胞，激活多個(gè)caspase蛋白，引起一種高度炎癥性的程序性細(xì)胞死亡(即焦亡)。細(xì)胞焦亡是于2001年發(fā)現(xiàn)的一種新型細(xì)胞程序性死亡方式，有別于細(xì)胞凋亡和壞死，表現(xiàn)為：細(xì)胞膜出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞破裂使內(nèi)容物釋放，引起炎癥反應(yīng)[9]。細(xì)胞焦亡為一種依賴于caspase-1活化的炎性細(xì)胞死亡方式，受到病原信號(hào)刺激的NLRP3可結(jié)合pro-caspase-1形成炎性復(fù)合體，促使其活化為caspase-1，caspase-1則促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟和釋放，另外caspase-1還能切割GSDMD，使其N端片段釋放后結(jié)合細(xì)胞膜的磷脂類分子，致使細(xì)胞膜上出現(xiàn)孔洞，細(xì)胞滲透壓發(fā)生變化，細(xì)胞腫脹膨大并最終破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外滲，造成細(xì)胞焦亡[10]。于此同時(shí)，細(xì)胞滲出物成為新的炎性刺激物，造成更加廣泛和劇烈的炎性反應(yīng)。Wen[11]等研究報(bào)道，清熱養(yǎng)陰?kù)顫裢枘芤种芅LPR3炎癥復(fù)合體激活，降低NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)，下調(diào)炎癥因子IL-1β和IL-18的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的發(fā)生，減輕關(guān)節(jié)炎。熊云昭[12]等報(bào)道，對(duì)梗阻性腎病大鼠模型給予化瘀解毒方灌藥，可下調(diào)細(xì)胞炎性因子IL-1β等的表達(dá)，減輕腎臟炎性損傷。大黃牡丹湯出自《金匱要略》，方中大黃可逐瘀解毒、牡丹皮清熱散瘀、芒硝軟堅(jiān)散結(jié)、桃仁破血、冬瓜仁利濕，使結(jié)瘀濕熱速下，消腫減痛[13]。本研究結(jié)果顯示，大黃牡丹湯可使LPS損傷腸上皮細(xì)胞活性顯著升高，降低細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞NLRP3、caspase-1和GSDMD-C蛋白表達(dá)顯著降低，IL-1β和IL-18含量顯著降低。提示大黃牡丹湯可能調(diào)控NLRP3/caspase-1通路，減少細(xì)胞焦亡。推測(cè)因大黃牡丹湯具有減輕炎癥反應(yīng)、阻止細(xì)胞焦亡的功效，可用于對(duì)炎癥性腸病的治療[14]。

綜上所述，大黃牡丹湯可抑制NLRP3/caspase-1信號(hào)通路的激活，降低細(xì)胞炎性反應(yīng)，對(duì)LPS誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞焦亡起保護(hù)作用。但中藥方的有效成分及作用機(jī)制較為復(fù)雜，且本研究并未設(shè)計(jì)陽性藥物處理組，因此，還需更多實(shí)驗(yàn)探究其具體作用機(jī)制，也是下一步研究重點(diǎn)方向。