楊夢霞，毛 昀，周 磊，朱世杰，王寧軍，蘆殿榮

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 2.中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102)

骨轉(zhuǎn)移癌是乳腺、肺和前列腺癌等惡性腫瘤常見并發(fā)癥，可引起疼痛、脊髓壓迫、病理性骨折等一系列臨床表現(xiàn)，給晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量帶來了嚴重不良影響[1]。目前多采用手術(shù)、放療、雙膦酸鹽類藥物治療等延緩骨轉(zhuǎn)移，但總體療效欠佳，且不良反應(yīng)明顯[2]。近年來中醫(yī)藥以其副作用少、療效佳等優(yōu)勢在骨轉(zhuǎn)移癌治療中取得了較好的臨床效果，在臨床上受到了廣泛關(guān)注[3]。骨轉(zhuǎn)移癌屬于中醫(yī)學(xué)骨痹、骨蝕、骨瘤、脛陰疽等范疇，其病機多為正虛邪實。其中正虛多為腎虛、陽虛，邪實多為寒、痰、血瘀和癌毒等，故在治療上應(yīng)重視扶正，并聯(lián)合溫陽活血、散寒化痰，攻毒抑癌等方法[4]。基于此，我院自擬溫陽活血湯治療陰寒凝滯型骨轉(zhuǎn)移癌，取得了較好的臨床療效，但尚未對其作用機制進行研究。近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)因其融合了系統(tǒng)藥理、生物學(xué)及計算機信息學(xué)等內(nèi)容的獨特優(yōu)勢，發(fā)展迅速，可通過多層次相互作用的中藥、化合物、靶點、疾病基因和信號通路網(wǎng)絡(luò)示意圖的構(gòu)建來探討中醫(yī)藥作用機理，是較為全新的一種方法。本研究擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討溫陽活血湯治療陰寒凝滯型骨轉(zhuǎn)移癌的分子機制，以期能夠在基礎(chǔ)研究中為后來學(xué)者提供新思路，在臨床上為醫(yī)生用藥提供一定參考價值。

1 資料與方法

1.1溫陽活血湯有效成分的篩選:在數(shù)據(jù)庫TCMSP中，以口服生物利用度OB、類藥性指數(shù)DL分別不小于30%和0.18為篩選條件，收集溫陽活血湯8味中藥化合物成分；此外，以TCMID、TCM Database@Taiwan為補充數(shù)據(jù)庫，并聯(lián)合文獻數(shù)據(jù)庫如知網(wǎng)、萬方等檢索溫陽活血湯相關(guān)成分。

1.2藥物有效成分作用靶點的預(yù)測:使用數(shù)據(jù)庫TCMSP查找主要有效成分相關(guān)靶蛋白,并結(jié)合Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢其對應(yīng)的Gene Symbol；在PubChem中獲取化合物有效成分的SMILES結(jié)構(gòu)，并在數(shù)據(jù)庫Swiss Target Prediction中將上述獲得的結(jié)構(gòu)輸入，且以“Homo sapiens”為篩選條件進行相關(guān)靶點的查詢，保留匹配度高的靶點，之后將兩個數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點進行去重，并在MCODE插件中進行核心基因的篩選。

1.3骨轉(zhuǎn)移癌潛在治療靶點篩選:本研究將“Gene”和“Homo sapiens”設(shè)置為檢索條件，在疾病基因數(shù)據(jù)庫DisGeNet和Drugbank中尋找骨轉(zhuǎn)移癌相關(guān)基因,最后去重。

1.4溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的主要潛在靶點:將藥物相關(guān)作用靶點和疾病基因在Venny2.1中進行映射，篩選出溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的靶點有105個。之后在STRING11.0數(shù)據(jù)庫中，輸入上述靶點并將“Homo sapiens”作為選擇物種，可獲得PPI互作網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape3.6.0中進行可視化。

1.5靶基因的功能分析:在DAVID數(shù)據(jù)庫中對溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的潛在靶點做GO和KEGG富集分析，其中GO分析包含了生物過程BP、細胞成分CC和分子功能MF。

2 結(jié) 果

2.1溫陽活血湯主要活性成分:在數(shù)據(jù)庫TCMSP、TCMID和TCM Database@Taiwan中檢索到溫陽活血湯所有化學(xué)成分共計707個。以O(shè)B、DL分別不小于30%和0.18為篩選閾值，并結(jié)合文獻檢索，合計有效成分共109個，見表1。

表1 溫陽活血湯的主要有效成分

leonticineSexangularetin13-methylpalmatrubinebeta-sitosterolN-methyllaurotetaninesitosterolnorglaucing黨參(21個)poriferasta-7,22E-dien-3beta-olPontevedrinePerlolyrinePseudocoptisineDiop24240-05-9ZINC03978781saulatineStigmasterolstylopine7-Methoxy-2-methylisoflavoneTetrahydrocorysamineSpinasteroltetrahydroprotopapaverineChrysanthemaxanthinST057701FrutinoneA2,3,9,10-tetramethoxy-13-methyl-5,6-dihydroisoquinolino[2,1-b]isoquinolin-8-oneluteolinStigmasterolTaraxerolPalmatinestigmast-7-enolFumarine3-beta-HydroxymethyllenetanshiquinoneIsocorypalminemethylicosa-11,14-dienoatebicuculline5alpha-Stigmastan-3,6-dioneC093677-(beta-Xylosyl)cephalomannine_qtquercetinDaturilin山慈菇(3個)beta-sitosterolglyciteinStigmasterolSpinosideA2-methoxy-9,10-dihydrophenanthrene-4,5-diol(8S,9S,10R,13R,14S,17R)-17-[(E,2R,5S)-5-ethyl-6-methylhept-3-en-2-yl]-10,13-dimethyl-1,2,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydrocyclo-penta[a]phenanthren-3-one補骨脂(3個)Daucosterol11-Hydroxyrankinidineisobavachin炙黃芪(1個)beta-sitosterolStigmasterol

2.2溫陽活血湯潛在治療靶點:在數(shù)據(jù)庫TCMSP和Swiss Target Prediction中檢索溫陽活血湯109個化合物的相關(guān)靶點，去重后保留高匹配度靶點，最終得到相關(guān)靶點374個。在數(shù)據(jù)庫STRING11.0中獲得374個相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape3.6.0中對此網(wǎng)絡(luò)作可視化分析，發(fā)現(xiàn)此網(wǎng)絡(luò)中包含節(jié)點369個和邊數(shù)7623條。在MCODE插件中進行基因篩選，得到158個核心基因，位于A、B、C三個子簇，見圖1。三個子簇包含的節(jié)點數(shù)分別為66、59和33；組成邊數(shù)分別為1686、426和182。

圖1 溫陽活血湯潛在治療靶點核心基因

2.3溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的主要潛在靶點:以“Bone metastasis”為檢索詞，在疾病基因數(shù)據(jù)庫DisGeNet和Drugbank中最終得到773個靶基因，與藥物374個相關(guān)靶點進行映射，見圖2；最后獲得105個溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的靶點，見圖3A。節(jié)點連接度Degree數(shù)值越大，說明有越多條邊與該節(jié)點相連，即該靶點越重要。據(jù)此，篩選出Degree值位于前25的關(guān)鍵靶點，見圖3。

圖2 溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的潛在治療靶點和骨轉(zhuǎn)移癌疾病靶點的韋恩圖

圖3 溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的105個靶基因(A)及核心基因(B)

2.4溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌靶基因的GO功能分析:在數(shù)據(jù)庫DAVID中對105個潛在治療靶點進行GO功能富集分析，共得到143條結(jié)果，其中BP、CC和MF分別涉及88項、11項和44項。以錯誤發(fā)現(xiàn)率FDR<0.05為篩選條件，獲得100個條目，其中BP63項、CC5項、MF32項，將BP、MF的前10項和CC的前5項繪制成氣泡圖來進行富集分析，見圖4。在BP方面，包括脂多糖介導(dǎo)的信號通路、5-羥色胺受體信號通路和細胞對血管內(nèi)皮生長因子刺激的反應(yīng)等；在CC中，涉及樹突、內(nèi)溶酶體腔、血小板α顆粒腔、受體復(fù)合物、蛋白質(zhì)細胞外基質(zhì)等；在MF方面，涉及G蛋白偶聯(lián)的5-羥色胺受體活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和蛋白激酶活性等。

圖4 溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌靶基因的GO功能富集分析

2.5溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌靶基因KEGG通路分析:通過對105個潛在治療靶點做KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，與溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌作用機理相關(guān)的通路有92條，以FDR<0.05為富集篩選條件，得到84條符合該條件的通路，取排名前25的通路在氣泡圖中進行富集功能分析，見圖5。相關(guān)通路主要有HIF-1信號通路、TNF信號通路、VEGF信號通路、ErbB信號通路、Toll樣受體信號通路、Rap1信號通路等。

圖5 溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌靶基因的KEGG通路富集分析

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為骨轉(zhuǎn)移癌發(fā)生機制與骨微環(huán)境和腫瘤細胞的相互作用有關(guān)，在轉(zhuǎn)移過程中，成骨細胞、破骨細胞兩者之間動態(tài)失衡所產(chǎn)生的環(huán)境，更加有利于腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[5]。中醫(yī)學(xué)認為罹患腫瘤的患者多處于邪正并存的狀態(tài)，故在治則上應(yīng)當扶正與驅(qū)邪并重，以改善機體狀態(tài)[6]。自擬溫陽活血湯中以干姜9g、肉桂10g和補骨脂20g溫陽；以紅花10g和延胡索20g活血；以黨參30g、炙黃芪30g和山慈菇20g扶正以驅(qū)邪，全方八位中藥共奏溫陽活血之功，但其作用機制尚未明確。

通過篩選溫陽活血湯的主要有效成分并構(gòu)建多層次相互作用的成分與靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)示意圖，發(fā)現(xiàn)槲皮素、豆甾醇、木犀草素、β-谷甾醇、山奈酚、黃芩素和β-胡蘿卜素等為其核心化合物，且大多數(shù)能抑癌、抗炎和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。其中槲皮素作為關(guān)鍵化合物，一方面可以通過抑制RANK-L、RANK等蛋白以及IL-8，TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達，增加OPG的水平，進一步降低PAR2/TRPV1通路中的相關(guān)分子(如PAR2,TRPV1等)和TNF-α和IL-1β的水平，最終使破骨細胞活化受抑、骨破壞程度得以下降[7]。豆甾醇和β-谷甾醇均可抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞產(chǎn)生和分泌多種炎癥介質(zhì)，如活性氧，一氧化氮和TNF-α，主要與NF-κB信號通路相關(guān)：其中TNF-α可通過對NF-κB激酶IKKβ的抑制功能來增加NF-κB，而NF-κB3抑制劑的泛素化可減少NF-κB[8]。木犀草素可通過抑制PCNA蛋白和MMP-9蛋白的表達及PI3K/AKT通路活化來阻礙宮頸癌HeLa細胞的增殖和遷移[9]。

通過Cytoscape3.6.0軟件構(gòu)建溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)示意圖，發(fā)現(xiàn)VEGFA、AKT1、IL6、TP53、ALB、CXCL8、CASP3、TNF、EGFR、EGF和MAPK3等為其關(guān)鍵靶點。VEGFA具有調(diào)節(jié)血管生成和促進癌細胞增殖的作用，其通路受到HIF和JAK/STAT通路的調(diào)節(jié)，且VEGFA信號級聯(lián)與MAPK通路有關(guān)[10]。促骨因子IL-6和TNF-α都可以刺激成骨細胞產(chǎn)生RANKL，可與RANK即破骨細胞前體表面的受體結(jié)合，刺激下游信號分子，包括MAPK和PI3K/AKT，并可對破骨細胞前體向功能性破骨細胞的轉(zhuǎn)化起促進作用。CXCL8，也稱為IL-8，通過與CXCR-1和CXCR2作用起調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中CXCL8上調(diào)，可增加ERK、p-ERK和凋亡抑制基因Survivin的表達，降低CASP3和BAX的表達，從而使癌細胞增殖和遷移能力增加[11]。

根據(jù)GO和KEGG富集分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，溫陽活血湯治療骨轉(zhuǎn)移癌的作用機制主要包含抑癌，調(diào)節(jié)骨微環(huán)境和腫瘤細胞等方面。當骨微環(huán)境缺氧時，HIF-1可啟動缺氧基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因?qū)ρ苌?、腫瘤細胞凋亡和生長因子/細胞因子活性至關(guān)重要。此外，HIF-1還可與生長因子/細胞因子(如VEGF,EGF等)相互作用，這些因子在癌細胞上的表達可進一步促進癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[12]。有研究表明，在缺血性壞死骨組織中TNF-α表達顯著上調(diào)，可激活p38MAPK/NF-κB信號通路。而抑制p38mapk/NF-κB通路可減弱TNF-α誘導(dǎo)的自噬作用，并增強TNF-α誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡[13]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，長非編碼RNA的SPRY4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄1可通過TNF信號通路促進肝細胞癌的進展和轉(zhuǎn)移[14]。Toll樣受體(TLR)可調(diào)節(jié)機體免疫功能和細胞代謝，其中TLR4是TLR家族中最具代表性的成員，包含兩條信號通路：一是MyD88依賴型通路，可通過催化TRAF6泛素化啟動NF-κB和MAPK表達,促進炎性細胞因子釋放；二是MyD88非依賴型通路，該通路可通過活化NF-κB以促進炎性因子釋放，也可激活干擾素誘導(dǎo)基因IP-10與調(diào)節(jié)活化正常T細胞表達與分泌的趨化因子[15]。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，可發(fā)現(xiàn)溫陽活血湯有效化合物為槲皮素、豆甾醇、木犀草素等，可通過HIF-1、TNF、VEGF等信號通路調(diào)控VEGFA、IL6、TNF等靶點，進而發(fā)揮抑癌、抗骨轉(zhuǎn)移和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用，對臨床上治療骨轉(zhuǎn)移癌用藥具有一定參考意義，但仍需后期基礎(chǔ)實驗加以驗證。