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        GnIH/RFRP-3通過受體GPR147抑制PI3K/AKT/mTOR通路誘導(dǎo)雌激素受體陽性人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的研究

        2021-12-01 00:46:02王鳳霞司麗娜楊松鶴程露陽喬躍兵馬秀艷
        河北醫(yī)學(xué) 2021年11期
        關(guān)鍵詞:孵育受體乳腺癌

        王鳳霞,魏 萌,司麗娜,楊松鶴,程露陽,喬躍兵,馬秀艷

        (1.承德醫(yī)學(xué)院,河北 承德 067000 2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,河北 承德 067000)

        乳腺癌是女性最常診斷出的癌癥,在女性癌癥相關(guān)死亡原因中位居第二[1]。在乳腺癌的分子分型中,以雌激素受體陽性(hormone receptor positive,HR+)者居多,約占 70%[2]。目前以手術(shù)切除和化療輔助為主要治療方式,但手術(shù)切除和化療輔助治療均會(huì)給患者產(chǎn)生嚴(yán)重的生理和心理創(chuàng)傷,尋求不同治療方式和藥物抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的增殖及活力尤為重要[3]。有研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)分泌治療手段可通過降低或競(jìng)爭性抑制腫瘤生長依賴的激素(主要為雌激素)或其受體,抑制腫瘤細(xì)胞增殖[4]。雖然內(nèi)分泌治療副作用較小,但會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象,所以尋求新的藥物尤為重要。因此,本文旨在研究一種由下丘腦分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌肽-促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone,GnIH),通過與受體GPR147結(jié)合經(jīng)下丘腦-垂體-性腺軸抑制促黃體生成素(luteinizing hormone ,LH)和卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,F(xiàn)SH)的分泌和釋放,調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)。所以,本研究應(yīng)用GnIH來探討其是否對(duì)雌激素受體陽性乳腺癌的凋亡造成影響及作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1細(xì)胞培養(yǎng):人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7在含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿的80%~90%按1∶2~3進(jìn)行傳代,取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

        1.2藥物及其配置:RPRF-3規(guī)格1g,購于Tocris Bioscience,U.K。將1g藥物溶于0.5mL PBS中配成2mg/mL的母液,每15μL分裝于EP管-20℃避光保存。15μL藥物溶液溶于培養(yǎng)基用0.22μm的無菌過濾器過濾,獲得10000ng/mL的GnIH藥物溶液,倍比稀釋配置成0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL的GnIH藥物溶液。RF9規(guī)格1mg,購于MedChemExpress(Monmouth Junction,NJ,USA)。將1mg抑制劑溶于0.2072mL DMSO中配成10mM的母液,每8μL分裝于EP管-20℃避光保存。

        1.3試劑:DMEM/RPML1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibco),Biological Industries(BI)公司特級(jí)胎牛血清(中美血源),cell counting kit-8(CCK-8)購于美國APExBIO,青霉素和鏈霉素、PBS、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于BD公司、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購自索萊寶公司,ECL 發(fā)光液購自大連美侖公司,兔單克隆抗體(Gapdh、Bcl-2、Bax、caspase-3、cytochrome C、Hsp90、P53、PI3K、AKT/p-AKT、mTOR)購于Abcam公司,GPR147兔單克隆抗體購于Bioss公司,羊抗兔二抗購于Abclone公司。

        1.4儀器:高速冷凍離心機(jī)購自北京大龍公司,化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能公司,酶標(biāo)儀購自BioTEK公司,電泳儀購自北京六一儀器廠,熒光定量PCR儀購于BIORAD公司(美國),雙控溫干式恒溫孵育器購自杭州米歐儀器。

        1.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增值率:收集對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞,以8×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中,在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h,吸棄培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組分別加入含GnIH濃度為(0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL)的培養(yǎng)基,設(shè)調(diào)零組和PBS對(duì)照組,每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24后取出,每孔加入100μLCCK-8試劑,于37℃恒溫箱中避光孵育2h,酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度(OD)值,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(PBS對(duì)照組OD值-GnIH實(shí)驗(yàn)組OD值)/(PBS對(duì)照組OD值-調(diào)零組OD值)。

        1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期,胰酶消化重懸繼續(xù)培養(yǎng)24h加藥,PBS對(duì)照組、GnIH實(shí)驗(yàn)組10000ng/mL培養(yǎng)24h。用不含乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶消化,DMEM完全培養(yǎng)基終止消化,計(jì)數(shù)1×105,PBS洗兩遍(1000r/min,5min),棄上清液,加入1×Bidding Buffer懸浮,轉(zhuǎn)移至流式管中,分別加入5μLAnnexin V-FITC和5 μL PI,輕輕渦旋細(xì)胞,室溫25℃暗室孵育15min,每個(gè)流式管加入400μL 1×Bidding Buffer,1h內(nèi)完成上機(jī)檢測(cè)。

        1.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)水平:使用Takare試劑盒提取MCF-7細(xì)胞各組總RNA,分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,經(jīng)PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,按照試劑盒操作方法檢測(cè)RNA表達(dá)水平,采用2-△△Ct法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量,本實(shí)驗(yàn)以GAPDH為內(nèi)參。

        1.8蛋白印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平:應(yīng)用Western Blot法對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。取MCF-7對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞懸液,按GnIH給藥濃度(0ng/mL、10000ng/mL)接種于底面積為21cm3的培養(yǎng)皿中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后加藥,繼續(xù)培養(yǎng)24h,取出各組細(xì)胞培養(yǎng)皿,吸棄培養(yǎng)基,用4℃預(yù)冷的PBS清洗,加適當(dāng)體積的含PMSF的RIPA裂解液于-80℃冰箱過夜,冰上裂解30min,收集細(xì)胞懸液,置于4℃低溫高速離心機(jī)中以12000r/mim離心15min,取上清。根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取蛋白上清1/4的Loading Buffer與上清液充分混合,100℃干式孵育器煮10mim,使蛋白變性,冷卻至室溫-20℃保存。用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本(20μg),分離后電流設(shè)定200mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2h,取相應(yīng)特異性一抗孵育2h(Bcl2 1∶800、Bax 1∶800、Caspase-3 1∶5000、cytochrome C 1∶5000、Hsp90 1∶10000、Gapdh 1∶10000、P531∶1000、PI3K1∶500、AKT1∶10000、p-AKT1∶1000、m-TOR1∶1000和GPR1471∶1000)均為兔單克隆抗體,4℃過夜,復(fù)溫30min,TBST洗膜緩沖液洗3次,加入HRP熒光標(biāo)記的二抗(1∶8000),室溫孵育1h,洗膜后加入ECL特超敏試劑,經(jīng)Tanon 6100凝膠成像儀掃描顯影。采用 Image J 軟件分析,通過比較目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值來確定目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

        2 結(jié) 果

        2.1GnIH對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響:與PBS對(duì)照組相比,經(jīng)GnIH(10000ng/mL)處理MCF-7細(xì)胞24h后,CCK-8檢測(cè)OD值明顯降低(P<0.05),對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖抑制率為9.272%。見表1。

        表1 GnIH對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響

        2.2GnIH誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的流式檢測(cè)結(jié)果:經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖1,GnIH分別按空白對(duì)照組和10000ng/mL藥物濃度加入到MCF-7作用24h后,其空白對(duì)照組和10000ng/mL組的凋亡率分別為(7.76±1.57)%和(16.14±3.001)%。各組間凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.164,P=0.0351)。見圖1。

        圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡情況

        2.3GnIH在mRNA水平上對(duì)凋亡相關(guān)基因的影響:在MCF-7中對(duì)照組和10000ng/mL實(shí)驗(yàn)組之間BaxmRNA表達(dá)水平上調(diào)(F=6.495,P<0.05)、Caspase-3mRNA表達(dá)水平上調(diào)(F=22.61,P<0.01)和TP53mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)(F=10.31,P<0.05)。同樣Bcl-2mRNA和Hsp90mRNA組間比較,Bcl-2mRNA的表達(dá)水平在10000ng/mL時(shí)顯著下降(F=18.26,P<0.01),Hsp90mRNA的表達(dá)水平與Bcl-2一致(F=12.1,P<0.01)。與對(duì)照組相比,PI3KmRNA與AKTmRNA的表達(dá)水平顯著下降(F=3.993,P<0.05;F=3.776,P<0.05),見表2。

        表2 相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平

        2.4凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:與對(duì)照組相比較,GnIH10000ng/mL實(shí)驗(yàn)組Bax(P<0.01)、Caspase-3(P<0.01)、cytochrome C(P<0.01)、P53(P<0.05)蛋白表達(dá)水平顯著升高,Bcl-2(P<0.01)蛋白表達(dá)水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

        圖2 Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

        (A 凋亡相關(guān)蛋白的印跡圖。B 凋亡相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量)

        2.5PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá):Western Blot結(jié)果顯示,經(jīng)10000ng/mL的GnIH作用MCF-7細(xì)胞24h后,與對(duì)照組比較PI3K、AKT/pAKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量依次降低;在10000ng/mL時(shí)與對(duì)照組比較PI3K、AKT/pAKT、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

        圖3 PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

        2.6MCF-7細(xì)胞系GRP147受體表達(dá)情況:對(duì)照組與GnIH實(shí)驗(yàn)組10000ng/mL相比較,MCF-7細(xì)胞系上的GPR147蛋白表達(dá)在10000ng/mL是表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見圖4。

        圖4 MCF-7細(xì)胞系GRP147受體表達(dá)情況

        2.7拮抗劑RF9干預(yù)后GnIH對(duì)相關(guān)蛋白的影響:抑制劑干預(yù)后,實(shí)驗(yàn)組GnIH10000ng/mL與對(duì)照組相比AKT/p-AKT蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05),GnIH10000ng/mL+抑制劑RF910μmoL實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組GnIH10000ng/mL比較,MCF-7細(xì)胞AKT/p-AKT蛋白表達(dá)量顯著增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖5。

        圖5 拮抗劑RF9干預(yù)后GnIH/RFRP-3對(duì)相關(guān)蛋白的影響

        3 討 論

        乳腺癌屬于激素依賴性腫瘤,雌激素與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在占比較高的HR+ 乳腺癌中,對(duì)抗雌激素的內(nèi)分泌治療效果是顯著的[5]。研究表明,GnIH通過下丘腦-垂體-性腺軸抑制促卵泡激素FSH、黃體生成素LH釋放,抑制卵泡顆粒層細(xì)胞增生分化,抑制卵巢發(fā)育,降低雌激素合成與分泌。有研究發(fā)現(xiàn)[6],促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)對(duì)細(xì)胞凋亡有影響,但作用機(jī)制尚不明確。

        G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor,GPCR)是一類七次跨膜的蛋白家族,與神經(jīng)遞質(zhì),激素等配體結(jié)合激活GPCR,使各種細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),從而在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中起重要作用,這也和人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。本研究使用的GnIH其受體為G蛋白偶聯(lián)受體147(G protein-coupled receptor147,GPR147)是GPCR家族成員,當(dāng)GnIH與其膜受體GPR147結(jié)合后,將GnIH從細(xì)胞外輸送到胞體內(nèi),引起細(xì)胞生長狀態(tài)的改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7膜上存在GPR147受體,并且隨著GnIH藥物濃度的升高,促進(jìn)了GPR147受體的表達(dá),造成MCF-7細(xì)胞的凋亡率增加。此外,激活的GPR147抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路參與了細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等多種生物學(xué)過程,并且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。PI3K通過激活絲氨酸/蘇氨酸酶AKT,AKT又通過大量的調(diào)節(jié)子最終造成絲氨酸/蘇氨酸酶MTOR的磷酸化。在腫瘤細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)途徑常處于被激活狀態(tài),從而維持其活躍的增殖能力。但是,本研究結(jié)果顯示GnIH在10000ng/mL時(shí)與對(duì)照組相比抑制了MCF-7細(xì)胞的PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白表達(dá)水平,表明當(dāng)GnIH達(dá)到10000ng/mL時(shí)較明顯抑制了PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,進(jìn)而抑制MCF-7的增殖。GPR147特異性拮抗劑RF9,可以抑制其受體活性,引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)[8,9]。本實(shí)驗(yàn)GnIH聯(lián)合RF9作用MCF-7細(xì)胞系,結(jié)果顯示抑制劑干預(yù)后,實(shí)驗(yàn)組GnIH1000ng/mL與對(duì)照組相比AKT/p-AKT蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05),GnIH1000ng/mL+抑制劑RF910μmoL實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)組GnIH1000ng/mL比較,MCF-7細(xì)胞AKT/p-AKT蛋白表達(dá)量顯著增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示,GnIH可能通過影響GPR147的活性發(fā)揮抑制MCF-7細(xì)胞增殖的效應(yīng)。

        細(xì)胞凋亡是細(xì)胞受特定基因調(diào)控的主動(dòng)性的有序死亡,主要由內(nèi)源性線粒體途徑發(fā)揮作用[10]。線粒體作為細(xì)胞凋亡的控制中心,當(dāng)細(xì)胞受到外界藥物刺激時(shí)會(huì)損傷線粒體功能,引起B(yǎng)cl-2家族中Bcl-2/Bax這兩種蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化[11]。p53是與癌癥相關(guān)的最常見突變基因,在多種應(yīng)激誘發(fā)的凋亡中起關(guān)鍵作用,當(dāng)細(xì)胞接受到凋亡信號(hào)后p53蛋白行使轉(zhuǎn)錄因子的作用上調(diào)Bax/Bcl-2比值,線粒體膜電位變化并最終提高線粒體外膜通透性,同時(shí)會(huì)將細(xì)胞色素C(cytochrome C,Cyto C)釋放至細(xì)胞質(zhì),進(jìn)一步激活caspase-3增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中可以看出,與對(duì)照組比較,GnIH1000ng/mL實(shí)驗(yàn)組P53、Bcl-2、Bax、Cytochrome c和Caspase-3蛋白表達(dá)水平無顯著變化,GnIH10000ng/mL實(shí)驗(yàn)組P53、Bax、Cytochrome c和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào),Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)。說明低劑量的GnIH對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡作用較小,而藥物劑量達(dá)到10000ng/mL時(shí)細(xì)胞凋亡率較顯著。

        熱休克蛋白(Heatshockprotein,HSP)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起重要作用的分子伴侶蛋白家族[12]。其中[13],HSP90是熱休克蛋白家族中最活躍的分子伴侶之一,PI3K和AKT都是HSP90重要伴侶蛋白。HSP90在多數(shù)腫瘤中高表達(dá),參與腫瘤的增殖、遷移和侵襲。結(jié)合Western Blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果,促性腺激素抑制激素對(duì)雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞HSP90蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)GnIH可以抑制HSP90的表達(dá),提示GnIH通過抑制HSP90的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)MCF-7的凋亡,推測(cè)GnIH作用腫瘤細(xì)胞可能與應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

        總之,GnIH可以抑制雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖。其作用機(jī)制可能通過GPR147受體抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路和激活線粒體凋亡途徑引起凋亡因子Bax和caspase凋亡家族上調(diào)有關(guān)。另外,由于GnIH抑制熱休克蛋白HSP90的表達(dá)可推測(cè),通過抑制腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而促進(jìn)凋亡。然而,本研究僅為體外實(shí)驗(yàn)未涉及到體內(nèi)實(shí)驗(yàn),并且對(duì)具體機(jī)制及其信號(hào)通路尚有欠缺,亟待后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

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