俞萍，張慶賀，姜虹延，張宇杰，馬玉玲，翟歡

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春，130117)

免疫力是指人對外界病毒的抵抗能力，主要來自人體自身的免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)為人體在復(fù)雜多變的內(nèi)外環(huán)境中處于平衡狀態(tài)提供可靠的保證，是人體健康的基石[1-2]。2019年底爆發(fā)的全球性公共衛(wèi)生事件“COVID-19”，截至2021年1月4日，全球確診病例數(shù)已超過8 000萬，死亡病例數(shù)超過180萬，相關(guān)病例病死率達到了2.22%[3]，其中患者大多為免疫力低下的中老年人[4]，這更讓人們深刻意識到增強免疫力的重要性。為滿足臨床需要，有必要開發(fā)新的功能食品或治療藥物來提高免疫功能，而天然產(chǎn)物尤其是藥食同源中藥被認(rèn)為是發(fā)掘潛在的免疫調(diào)節(jié)作用成分的重要來源。

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Meyer)的干燥根和根莖[5]，以人參為代表的中藥由于其安全性和多靶點的優(yōu)勢[6]，在提高免疫力方面有著重要的作用[7]，通過人參的免疫刺激作用可有助于治療病理依賴于降低吞噬能力的疾病[8-9]。近年來，隨著人參被列為新資源食品[10]，其食用價值深受人們的信賴及喜愛，人參系列產(chǎn)品應(yīng)運而生，如人參保健酒、人參多糖發(fā)酵乳飲料與人參紅景天片等[11-13]。具有提高免疫力功能的人參功能因子及相應(yīng)產(chǎn)品有待進一步的開發(fā)與研究。人參發(fā)揮多重藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要有皂苷、糖肽、多糖、多肽、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油等成分[14-16]。人參糖肽復(fù)合物(ginseng glycopeptides，Ggp)是由多糖、肽和糖肽組成的一類非皂苷類大分子化合物的混合物，同時具備糖類和肽類的雙重特性，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有多種生物活性，如降血糖、降血脂、保護神經(jīng)細(xì)胞、抗炎鎮(zhèn)痛、改善認(rèn)知障礙、增強記憶力、鎮(zhèn)靜、降膽固醇等[17]，目前，對于其提高機體免疫力功能的研究較少。此外，糖肽類物質(zhì)的生物活性一方面受本身糖蛋白性質(zhì)的影響，另一方面與其自身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)有關(guān)，其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性主要是由糖肽的單糖組成及連接方式、氨基酸組成及連接方式、糖-肽結(jié)合位點的多樣性決定的，而這些因素都與其分子質(zhì)量息息相關(guān)，分子質(zhì)量不同，結(jié)構(gòu)組成不同，其相應(yīng)的生物學(xué)活性也不同。隨著各種天然生物活性糖蛋白的不斷發(fā)現(xiàn)和研究，對糖肽的開發(fā)也成為了一大研究熱點[18]。因此，本研究擬通過水提醇沉法、酶解法與透析法相結(jié)合制備不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物，采用建立環(huán)磷酰胺致免疫低下動物模型研究其免疫調(diào)節(jié)活性，旨在挖掘人參提高免疫力的物質(zhì)基礎(chǔ)，探討不同分子質(zhì)量的人參糖肽對免疫活性的影響，擴展人參糖肽的潛在臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5年生人參，由吉林省怡生對外貿(mào)易有限公司提供，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)陳長寶教授鑒定為五加科植物人參的干燥根和根莖；BALB/c小鼠，SPF級，體重18～21 g，雌性，許可證號為SCXK(遼)2020—0001，遼寧長生生物技術(shù)有限公司；風(fēng)味蛋白酶(食品級)，河南萬邦實業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶(食品級)，浙江一諾生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)，碧云天生物技術(shù)有限公司；環(huán)磷酰胺注射液，規(guī)格200 mg/支，Baxter Oncilogy Gat；香菇菌多糖片，規(guī)格15 mg/片(批號：20010104)，開封制藥(基團)有限公司生產(chǎn)；2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB)，Macklin；RPM1I640完全培養(yǎng)液，Gibco；YAC-1，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；乙二胺四乙酸二鉀、印度墨汁、Na2CO3，上海源葉生物科技有限公司；Hank′s液、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶Ⅰ、0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液、2.5%Triton， Solarbio；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IH-H208C型富士寶電磁爐，佛山市富士寶電器科技股份有限公司；JJ-1型增力電動攪拌器，江蘇金壇市江南儀器廠制造證；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELA-FDU2100型凍干機，東京理化器械株式會社；M200 pro型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN集團公司；ZQZY-85CNS型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；XT200i型動物全血細(xì)胞分析儀，Sysmex；LSCO150 型CO2培養(yǎng)箱，Themo Fisher Scientific；LC20A 型高效液相色譜儀，SHIMADZU。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同分子質(zhì)量人參糖肽的制備

人參糖肽制備工藝流程如下：

取適量人參粗粉→浸泡30 min→14倍蒸餾水煎煮提取1 h、 提取3次、過濾→合并濾液、濃縮→使用70%乙醇醇沉→抽濾得沉淀→人參糖蛋白粗提物(純度>90.1%)→加入蒸餾水使底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%→加入風(fēng)味蛋白酶∶木瓜蛋白酶(質(zhì)量比1∶1) 使加酶量為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))→用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至6→置50 ℃水浴鍋水浴4 h→100 ℃滅酶10 min→酶解液離心→上清液冷凍干燥→人參糖肽粗提物(純度>88.4%)→加水溶解→使用截留分子質(zhì)量為14～8 kDa、 7 kDa和1 kDa透析袋進行透析→透析內(nèi)外液冷凍干燥→對樣品進行分子質(zhì)量分布的測定，得到14 kDa(純度>85.1%)、11kDa(純度>89.8%)和<1 kDa(purity>86.4%)的3組人參糖肽。

分子質(zhì)量分布的測定：通過高效液相色譜分析系統(tǒng)，以分子質(zhì)量為12 000、 5 000、1 000、180 Da的葡聚糖與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用GPC軟件計算分子質(zhì)量的分布，選用Sepax Technologies SRT SEC-100色譜柱(7.8 mm×300 mm，5 μm)，流動相為0.7% Na2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃。

1.3.2 人參糖肽增強免疫力功能實驗

1.3.2.1 動物造模、分組及給藥

將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的270只BALB/c小鼠，分為3批，每批90只，每批小鼠隨機分9組(n=10)：空白對照組(Blank)、陽性對照組[香菇菌多糖片，20 mg/(kg·d)，PC]、模型對照組[環(huán)磷酰胺，50 mg/(kg·d)， Model]、人參糖肽總提取物低劑量組[70 mg/(kg·d)，Ggp-L]、人參糖肽總提取物中劑量組[140 mg/(kg·d)，Ggp-M]、人參糖肽總提取物高劑量組[210 mg/(kg·d)，Ggp-H]、14 kDa人參糖肽[93.4 mg/(kg·d)，Ggp-1]、11 kDa人參糖肽[33.6 mg/(kg·d)， Ggp-2]、<1 kDa人參糖肽[29.4 mg/(kg·d)， Ggp-3]，其中，3個不同分子質(zhì)量組的給藥劑量根據(jù)各自的提取率等同于人參糖肽總提取物高劑量組，各組連續(xù)灌胃給予受試物30 d，空白對照組與模型組給予等體積生理鹽水。在第3周后開始以50 mg/(kg·d)的劑量隔天腹腔注射環(huán)磷酰胺，共注射5次，建立小鼠免疫力低下模型。實驗結(jié)束后，頸椎脫臼法處死小鼠，分別進行免疫器官指數(shù)、小鼠碳廓清實驗、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)、外周血白細(xì)胞總數(shù)及NK細(xì)胞活性測定實驗。

1.3.2.2 外周白細(xì)胞總數(shù)測定

以摘除小鼠眼球的方法采集全血，24 h內(nèi)以全血細(xì)胞分析儀檢測白細(xì)胞總數(shù)。

1.3.2.3 小鼠碳廓清實驗

稱量小鼠體重，以0.1 mL/10g的注射量將生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁注入小鼠尾靜脈。注入墨汁后，立刻計時，在2和10 min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，立即加至2 mL Na2CO3溶液中，在酶標(biāo)儀600 nm處測吸光度，以Na2CO3溶液為空白對照。用頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟、脾臟和胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。一般以校正的吞噬指數(shù)a表示小鼠碳廓清能力。計算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：a，吞噬指數(shù)；K，廓清指數(shù)；A1，2 min的吸光度；A2，10 min的吸光度；t1=2 min；t2=10 min。

1.3.2.4 小鼠DTH

用脫毛膏將每只小鼠腹部皮膚脫毛約1 cm×1 cm， 用DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏，5 d后用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(2面)進行攻擊，放回籠子，24 h后用頸椎脫臼法處死小鼠，以左右耳重的差值作為遲發(fā)型超敏反應(yīng)值。

1.3.2.5 NK細(xì)胞活性測定

實驗前24 h將新鮮的且存活率大于95%的靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)進行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以Hank′s液洗清3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4 ×105個/mL。將每只小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank′s液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液。用Hank′s液清洗 2次， 1 000 r/min離心10 min棄上清液。細(xì)胞沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，再加入Hank′s液，1 000 r/min離心10 min，用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個/mL。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL(效靶比50 ∶1)，加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%Triton各100 μL；上述各項均設(shè)3個復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h， 然后將96孔培養(yǎng)板1 500 r/min離心5 min，每孔吸取上清液100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)3 min，每孔加入30 μL 1 mol/L 的HCl溶液，在酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度。計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0,自然釋放孔吸度光；A1，反應(yīng)孔吸光度；A2，最大釋放孔吸光度。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 分子質(zhì)量分布測定

HPLC及GPC軟件分析得到人參糖肽的平均分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布，按照試驗條件通過截留分子質(zhì)量為14～8 kDa、7 kDa和1 kDa透析袋透析后，得到的人參糖肽平均分子質(zhì)量為13 867、11 086、446 Da，能夠較好地滿足14、11 kDa和<1 kDa人參糖肽的要求。人參糖肽的分子質(zhì)量分布見表1。

表1 人參糖肽的分子質(zhì)量分布 單位：%

2.2 人參糖肽增強免疫力功能測定

2.2.1 外周血白細(xì)胞總數(shù)測定

白細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答的血細(xì)胞，白細(xì)胞總數(shù)及各種白細(xì)胞百分比會因產(chǎn)生炎癥或疾病而變化，因此白細(xì)胞數(shù)是評價免疫作用的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[19]。Model組白細(xì)胞計數(shù)明顯低于Blank組(圖1-a，P<0.01)。與Model組相比，PC組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)極顯著增加(P<0.01)；人參糖肽復(fù)合物3個劑量組的Ggp-L組的小鼠外周血白細(xì)胞顯著提高(P<0.05)，Ggp-M與Ggp-H組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)均極顯著提高(P<0.01)； Ggp-1與Ggp-3組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)均極顯著提高(P<0.01)，Ggp-2組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)顯著提高(P<0.05)。與Ggp-H組相比，Ggp-1組無明顯變化(P>0.05)，Ggp-2組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)，而Ggp-3組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)顯著提高(P<0.05)。結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺可使小鼠的白細(xì)胞計數(shù)顯著降低，使小鼠免疫功能下降。人參糖肽復(fù)合物能促進環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制小鼠白細(xì)胞的形成，提高機體免疫力作用，且具有劑量依賴性，低分子質(zhì)量的人參糖肽效果更明顯。

2.2.2 小鼠體重及免疫器官指數(shù)

如表2所示，灌胃給予不同劑量和不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物30 d，不會導(dǎo)致小鼠死亡，與Blank組相比體重?zé)o顯著降低，表明人參糖肽復(fù)合物不會對小鼠產(chǎn)生毒性作用；脾臟和胸腺作為外周免疫器官和中樞免疫器官，是參與免疫反應(yīng)的主要場所，免疫器官指數(shù)的變化可以初步反映藥物對免疫器官以及免疫調(diào)節(jié)是否具有影響[20]。與Blank組相比，Model組脾臟和胸腺指數(shù)均有顯著下降(P<0.05)； 給藥組與Model組相比，免疫器官指數(shù)均有明顯的提高(P<0.05)。結(jié)果表明，人參糖肽復(fù)合物與不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物均能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺所致的小鼠的免疫器官指數(shù)的下降，可逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫器官萎縮，說明人參糖肽復(fù)合物對兩大免疫器官具有保護作用。

表2 小鼠體重及免疫器官指數(shù)實驗結(jié)果

2.2.3 碳廓清實驗

巨噬細(xì)胞對先天性免疫具有重要作用，可以通過分泌各種細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)機體免疫能力，血液中的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)具有對進入體內(nèi)的異物吞噬清除的功能，因此可通過吞噬率來反映單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能[21-22]。從圖1-b可以看出，與Blank組相比，Model組免疫抑制小鼠碳廓清吞噬指數(shù)顯著降低(P<0.05)。與Model組相比，PC組的小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)極顯著提高(P<0.01)；人參糖肽復(fù)合物3個劑量組的Ggp-L組的小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)顯著提高(P<0.05)，Ggp-M與Ggp-H組的小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)均極顯著提高(P<0.01)，且隨著給藥劑量的增大吞噬指數(shù)呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；Ggp-1組小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)極顯著提高(P<0.01)，Ggp-2與Ggp-3組小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)均顯著提高(P<0.05)。與Ggp-H組相比，Ggp-1組無顯著性差異(P>0.05)， Ggp-2、Ggp-3組小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，人參糖肽復(fù)合物與不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物能夠一定程度上增強小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能，提高小鼠的非特異性免疫應(yīng)答水平。且人參糖肽復(fù)合物的吞噬能力與人參糖肽復(fù)合物的劑量和分子質(zhì)量有關(guān)，高劑量和高分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物對改善巨噬細(xì)胞吞噬功能有較好的作用。

2.2.4 DTH實驗

DTH是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)，DTH需要被激活的T淋巴細(xì)胞特異性識別特定抗原，從而增殖并釋放細(xì)胞因子[23-24]。在本研究中，我們使用DNFB作為抗原誘導(dǎo)的耳部DTH來評估人參糖肽復(fù)合物在機體細(xì)胞免疫功能的狀況。根據(jù)DTH耳腫脹試驗的結(jié)果(圖1-c)，Model組與Blank組相比，Model組DTH程度極顯著降低(P<0.01)。與Model組相比，PC組小鼠DTH程度極顯著提高(P<0.01)；人參糖肽復(fù)合物3個劑量組的Ggp-L組的小鼠DTH程度顯著增加(P<0.05)，Ggp-M與Ggp-H組的小鼠DTH程度均極顯著增加(P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性；Ggp-1、Ggp-2、Ggp-3組小鼠DTH程度均極顯著提高(P<0.01)。與Ggp-H組相比，Ggp-1組DTH程度極顯著降低(P<0.01)，Ggp-2、Ggp-3組小鼠DTH程度均極顯著提高(P<0.01)。結(jié)果表明，人參糖肽復(fù)合物與不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物能夠在一定程度上改善環(huán)磷酰胺對DTH的抑制作用，增強環(huán)磷酰胺處理的小鼠細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能，說明低分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物可能對增強細(xì)胞免疫效果更好。

2.2.5 NK細(xì)胞活性測定

NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，是機體抗腫瘤、抗感染的一種重要免疫細(xì)胞[25]。本文采用LDH法測定環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠NK細(xì)胞活性。如圖1-d所示，與Blank組相比，Model組NK細(xì)胞活性極顯著降低(P<0.01)。與Model組相比，Ggp-L組無顯著性差異(P>0.05)，Ggp-M、Ggp-H組的小鼠NK細(xì)胞活性均極顯著增加(P<0.01)， 且呈一定的劑量依賴性；PC組、Ggp-1、Ggp-2、Ggp-3組小鼠NK細(xì)胞活均極顯著提高(P<0.01)。與Ggp-H組相比，Ggp-1組NK細(xì)胞活性極顯著降低(P<0.01)， Ggp-2、Ggp-3組無明顯變化(P>0.05)。結(jié)果表明，人參糖肽復(fù)合物與不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物能夠在一定程度上增加NK細(xì)胞的活力，且效果與臨床常用免疫促進劑藥香菇菌多糖相似。因此，人參糖肽復(fù)合物可能通過促進環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，且其作用效果隨分子質(zhì)量的降低而增強。

a-白細(xì)胞計數(shù)；b-碳廓清實驗；c-DTH；d-NK細(xì)胞活性

3 結(jié)論

人參糖肽總提取物及重均分子質(zhì)量在14、11 kDa和<1 kDa的3種人參糖肽對免疫功能低下小鼠均具有升高外周血白細(xì)胞總數(shù)，促進免疫器官生長發(fā)育，增強小鼠DTH和吞噬細(xì)胞的吞噬能力，提高NK細(xì)胞活性的作用，且較低分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物的免疫效果相對更明顯，均具有增強免疫力的功能。后續(xù)將對人參糖肽的結(jié)構(gòu)以及其調(diào)節(jié)免疫活性的機理進行研究，為開發(fā)具有提高免疫力功效的保健食品及藥品提供了潛在活性成分和應(yīng)用依據(jù)。