宋美潔，吳翠玲，趙柳微，吳黎明，盧煥仙，薛曉鋒*

1(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京，100093) 2(安捷倫科技(中國)有限公司，北京，100102)3(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 紅河哈尼族彝族自治州，661100)

紅霉素(erythromycin A，EA)是由鏈霉素所產(chǎn)生的一種堿性大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在酸性條件下易降解產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，如脫水紅霉素、紅霉素A烯醇醚和偽紅霉素A烯醇醚等[1]。在蜂業(yè)生產(chǎn)中，紅霉素被用于防治意蜂的美洲幼蟲腐臭病，特別是對土霉素有抗性的美洲幼蟲腐臭病[2]。紅霉素的不合理使用導(dǎo)致紅霉素及其降解物在蜂產(chǎn)品中殘留，對蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全和人體健康帶來潛在風(fēng)險。

紅霉素的降解產(chǎn)物不具有抗微生物特性，且脫水紅霉素和紅霉素A烯醇醚被認為是人類在紅霉素治療中產(chǎn)生胃腸不適的原因[3]。蜂蜜的pH為3.3～6.5[4]，蜂王漿的pH為4.0～4.5[5]，兩者均為酸性介質(zhì)，紅霉素極易在其中降解殘留，引發(fā)人體過敏反應(yīng)等不良副作用[6]。但目前尚未有紅霉素降解物殘留測定的相關(guān)標準參考，因此，建立蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物殘留的分析方法對于監(jiān)測蜂產(chǎn)品中紅霉素殘留情況以及保障蜂產(chǎn)品的消費安全具有實際意義。

目前，關(guān)于對蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物的定量檢測方法報道較少，在我國標準及相關(guān)文獻中關(guān)于紅霉素的測定方法主要是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，前處理技術(shù)主要采用固相萃取法[6-10]，但操作步驟繁瑣、試劑消耗量大，不適于批量樣品檢測。QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged, safe)法是集萃取和凈化為一體的前處理技術(shù)，具有操作簡便快速、環(huán)境友好、檢測高效等優(yōu)點，常用于提取食品中的農(nóng)藥和獸藥殘留等化學(xué)污染物[11-12]。但尚無使用QuEChERS法同時提取蜂產(chǎn)品中紅霉素及其降解物的研究，故本研究采用QuEChERS法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立了蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀、6495三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；萬分之一天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；CR22G 高速冷凍離心機，日本日立公司；G560E渦旋混勻器，美國Scientific Industries 公司。

甲醇和乙腈(色譜純)，德國Merck公司；甲酸(色譜純)，美國Fluka公司；紅霉素、脫水紅霉素、偽紅霉素A烯醇醚和紅霉素A烯醇醚標準品(純度≥99%)，加拿大 TRC公司。

稱取適量標準品，在避光條件下，分別用甲醇配制成1 000 mg/L的儲備液并儲存在-20 ℃冰箱中(現(xiàn)配現(xiàn)用)。根據(jù)實驗需要用乙腈稀釋標準儲備液，配成適當(dāng)濃度的標準工作溶液。

1.2 樣品前處理

分別稱取5.00 g(精確到0.01 g)蜂蜜樣品或2.00 g (精確到0.01 g)蜂王漿樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水使樣品完全溶解，加入10 mL乙腈經(jīng)渦旋1 min，超聲提取10 min后，加入脫水試劑 (4 g無水硫酸鈉和1 g氯化鈉)，渦旋振蕩1 min，以8 000 r/min離心10 min，取5.0 mL上清液于分散固相萃取管 [400 mg N-丙基乙二胺(primary secondary amine, PSA)+1 200 mg 無水硫酸鎂]，渦旋混勻1 min后于8 000 r/min速率下離心10 min，所得上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3 測定條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×100 mm×2.7 μm)；流動相 A：含0.1%(體積分數(shù)，下同)甲酸的水溶液；流動相 B：甲醇；梯度程序：0～1 min： 55%～60% B，1～4 min：60%～75% B，4～5 min： 75%～98% B，5～7 min：98% B；進樣量：2 μL； 柱溫：30 ℃；運行時間：7 min；流速：0.3 mL/min；后運行時間：2 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式(ESI+)；多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)；離子源溫度：250 ℃；干燥氣流速：15 L/min；干燥氣壓力：45 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；離子源電壓：3 500 V；紅霉素及其降解物的定性，定量離子對等質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將配制的紅霉素及其降解物的標準貯備液稀釋成質(zhì)量濃度為 500 ng/mL 的標準工作溶液，采用ESI+對其進行全掃描。進入一級質(zhì)譜后，得到穩(wěn)定的紅霉素及其降解物4種物質(zhì)的[M+H]+離子峰，進一步對子離子、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化。獲得紅霉素、脫水紅霉素、偽紅霉素A烯醇醚和紅霉素A烯醇醚的二級質(zhì)譜全掃描圖后，選擇離子豐度最高、基質(zhì)干擾最小的2個離子對作為特征離子對，將信號響應(yīng)最高的離子對作定量離子，響應(yīng)次高的作定性離子。設(shè)定合適的峰駐留時間確保色譜峰的采樣點數(shù)在15～20點，從而得到較好的定量重復(fù)性，進行樣品分析時結(jié)合化合物的保留時間。得到的離子對及其對應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 紅霉素及其降解物的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗選擇了甲醇-0.1%甲酸水溶液，0.1%甲酸水-乙腈組成的流動相體系，發(fā)現(xiàn)0.1%的甲酸水和甲醇為流動相時，4種物質(zhì)的離子化效率最佳。為了降低基質(zhì)干擾，增強分離度以及延長色譜柱的使用壽命，在優(yōu)化梯度洗脫程序后，實現(xiàn)了紅霉素及其降解物的良好分離。得到的TIC圖譜如圖1所示。

a-紅霉素A；b-脫水紅霉素；c-偽紅霉素A烯醇醚；d-紅霉素A烯醇醚A-蜂蜜空白；B-蜂王漿空白；C-蜂蜜樣品；D-蜂王漿樣品

2.2 前處理條件的優(yōu)化

蜂蜜的主要成分為糖類物質(zhì)，此外還含有少量的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)、有機酸、類胡蘿卜素、酶和芳香物質(zhì)等[13]。蜂王漿中含有多種生物活性物質(zhì)，如游離氨基酸、蛋白質(zhì)、糖、脂肪酸、礦物質(zhì)和維生素等，其中蛋白質(zhì)占新鮮蜂王漿的12%～15%[14]。基質(zhì)較為復(fù)雜，為了提高蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物的提取效率，降低基質(zhì)干擾，應(yīng)盡可能地除去糖類、蛋白和脂類干擾物，建立穩(wěn)定、可靠、回收率高的樣品前處理方法。

2.2.1 提取溶劑的選擇

乙腈和弱酸性緩沖溶液在QuEChERS方法中常被用作提取溶劑，但紅霉素易溶于極性有機溶劑且在酸性條件下不穩(wěn)定。試驗分別選擇甲醇、乙腈和乙酸乙酯作為提取試劑進行考察。結(jié)果表明，相對于甲醇提取液來說，乙腈提取液較易分層，水分較少。原因在于乙腈對糖的溶解性較小，在水中的溶解度低于甲醇，且具有沉淀蛋白的作用。而將乙酸乙酯作為提取溶劑時，產(chǎn)生嚴重乳化現(xiàn)象，回收率低，重復(fù)性差。因此，最終選擇乙腈作為本研究的提取劑。此外，根據(jù)相關(guān)研究[15]，鹽析劑選用了4 g 硫酸鈉和1 g 氯化鈉，在去除水分的同時，可促進提取液乙腈層和水層的分離。

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

萃取溶液中干擾物的存在可能會影響色譜分離，并增強或降低目標分析物的離子信號，也會導(dǎo)致離子源的污染。為了解決這個問題，研究選擇了不同的吸附劑進行組合凈化。無水MgSO4、PSA、C18和石墨化炭黑(graphitized carbon black,GCB)是常用的吸附劑材料。PSA 在硅膠上鍵合了乙二胺-N-丙基官能團，主要作用是去除蜂蜜、蜂王漿提取物中的極性色素、脂肪酸、有機酸和糖類物質(zhì)[16]。MgSO4作為一種干燥劑，可用于去除有機溶劑中的痕量水[17]，樣品含水量越少PSA凈化效果越好，結(jié)合合適的無水MgSO4用量能發(fā)揮更好的凈化作用。C18產(chǎn)生強非極性相互作用，可以吸附蜂蜜和蜂王漿中的一些脂質(zhì)等非極性、弱極性的化合物[18]。GCB具有特殊的層狀結(jié)構(gòu)，對去除色素以及固醇類雜質(zhì)有很好的效果[19]。

試驗比較了MgSO4+PSA、MgSO4+PSA+C18和MgSO4+PSA+C18+GCB的凈化效果。稱取一定量的蜂蜜、蜂王漿樣品并加標，考察在相同量下，使用不同混合比例的分散劑對加標回收率的影響，結(jié)果見圖2。 在有GCB和C18吸附劑存在的條件下，紅霉素在蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)中的回收率較低，且明顯低于脫水紅霉素、偽紅霉素A烯醇醚和紅霉素A烯醇醚3種降解物，說明對紅霉素具有吸附作用。在對蜂蜜樣品進行凈化時，考慮到蜂蜜中的脂質(zhì)較少，首先采用150 mg PSA+900 mg MgSO4的吸附劑，發(fā)現(xiàn)4種目標物質(zhì)在蜂蜜樣品中的回收率均低于70%，顯然凈化效果不夠，而后選擇了400 mg PSA+1 200 mg MgSO4比例的吸附劑，發(fā)現(xiàn)回收率顯著高于前者。在對蜂王漿樣品進行凈化時，首先采用400 mg PSA+1 200 mg MgSO4+400 mg C18EC的吸附劑，發(fā)現(xiàn)紅霉素和偽紅霉素A烯醇醚的回收較低，說明C18對兩者具有吸附作用。之后采用400 mg PSA+1 200 mg MgSO4的吸附劑，紅霉素回收率顯著提高。因此，綜合蜂蜜和蜂王漿樣品中紅霉素及其降解物脫水紅霉素、偽紅霉素A烯醇醚和紅霉素A烯醇醚的回收率情況，最終選擇了400 mg PSA+1 200 mg MgSO4的吸附劑。

A-蜂蜜；B-蜂王漿

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

基質(zhì)效應(yīng)是基質(zhì)共提物干擾目標化合物的離子化，使得目標化合物在儀器上的響應(yīng)發(fā)生了增強或者抑制的現(xiàn)象，從而影響目標物的定量測定。本研究采用提取后加入法和絕對基質(zhì)相應(yīng)法來評價基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect,ME)計算如公式(1)所示[20]：

(1)

以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制基質(zhì)匹配校準曲線和溶劑校準曲線，計算并評價了紅霉素及(其降解物在蜂蜜和蜂王漿中的基質(zhì)效應(yīng)。當(dāng)ME<-20%時，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)；-20%≤ME≤20% 時，表現(xiàn)為弱基質(zhì)效應(yīng)；ME>20% 時，表現(xiàn)為基質(zhì)增強效應(yīng)。

按照建立的樣品前處理方法處理空白樣品，用得到的空白基質(zhì)提取液將標準工作液逐級稀釋至0.2、2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL，獲得基質(zhì)匹配標準曲線溶液；同時用乙腈稀釋標準工作液至0.2、2.0、5.0、10.0、50.0和100.0 ng/mL，獲得溶劑標準曲線溶液。如表2所示，在0.2～100 ng/mL線性范圍內(nèi)蜂王漿基質(zhì)標線性關(guān)系良好，在0.2～50 ng/mL線性范圍內(nèi)蜂蜜基質(zhì)標線性關(guān)系良好。ME值為-51%～2%， 表明存在基質(zhì)效應(yīng)。因此，選用基質(zhì)匹配標準曲線對蜂蜜和蜂王漿中的紅霉素及其降解物進行定量。用MassHunter定量軟件計算得到各目標化合物線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)。如表2所示，各化合物的線性關(guān)系良好，均大于0.99。相關(guān)研究報道方法中，蜂蜜中紅霉素A、紅霉素 A 烯醇醚和脫水紅霉素 A 的檢出限、定量限分別為0.5和2.0 μg/kg[7]；蜂王漿中紅霉素 A、紅霉素 A 烯醇醚、脫水紅霉素A的檢出限和定量限分別為0.5和5.0 μg/kg[6]，而本研究建立了同時測定蜂蜜和蜂王漿中紅霉素 A、紅霉素 A 烯醇醚、脫水紅霉素 A和偽紅霉素A烯醇醚4種化合物的檢測方法，檢出限[信噪比(S/N≥3)]為0.2～0.63 μg/kg，定量限(S/N≥10)為0.5～1.9 μg/kg，與先前研究相比，本方法具有更低的檢出限和定量限。

表2 基質(zhì)匹配標準曲線與溶劑標準曲線的比較

2.3.2 準確度和精密度

由于蜂王漿和蜂蜜成分復(fù)雜，且組分存在差異，故對樣品的稱樣量進行了優(yōu)化，分別稱取5 g蜂蜜和2 g蜂王漿進行后續(xù)前處理操作，在蜂蜜和蜂王漿樣品中分別添加5.0、10.0、25.0 μg/L的紅霉素及其降解物的標準儲備液進行加標回收試驗，每個加標濃度設(shè)定6個平行，并做空白實驗。標準曲線采用空白基質(zhì)樣品前處理后添加標準品并制備成系列工作溶液的方法進行測定和繪制，考察了紅霉素及其代謝物的回收率和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。研究發(fā)現(xiàn)不同添加濃度的分析物平均回收率范圍為70%～93%，RSD≤4.0%。方法具有良好的回收率和重現(xiàn)性，可實現(xiàn)現(xiàn)蜂蜜和蜂王漿基質(zhì)中紅霉素及其降解物的準確分析測定。

表3 紅霉素及其降解物蜂蜜、蜂王漿基質(zhì)中的添加回收率

2.4 實際樣本的測定

從市場分別抽檢30個蜂蜜和蜂王漿樣品，應(yīng)用本方法進行檢測，以保留時間和碎片離子定性，外標法定量，結(jié)果表明，紅霉素及其降解物均未檢出。

3 結(jié)論

本文通過優(yōu)化色譜條件、質(zhì)譜條件、QuEChERS方法的提取溶劑和凈化吸附材料，實現(xiàn)了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解物殘留的定性定量。本法快速、準確、靈敏度高、操作簡單，方法檢出限為0.2～0.63 μg/kg，定量限為0.5～1.9 μg/kg，回收率為70%～93%，RSD為0.4%～4.0%。方法已經(jīng)應(yīng)用于實際樣品測定，抽檢的樣品中未檢測到紅霉素及其代謝物。建立的方法可以形成標準檢測方法用于蜂蜜和蜂王漿中紅霉素及其降解產(chǎn)物的日常檢測。