曾嬌嬌，余世琴，周景文*

1(江南大學 生物工程學院，工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(未來食品科學中心(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

酪醇[2-(4-羥基苯基)乙醇，tyrosol]是一種天然的多酚類物質，廣泛存在于紅景天、女貞、橄欖等植物中，具有抗氧化、消炎等多種藥理活性[1]。目前酪醇的合成主要有植物提取、化學合成及微生物代謝生產3種途徑。由于植物提取率低、化學合成反應復雜等問題的存在，微生物細胞工廠的優(yōu)勢逐漸凸顯。在微生物代謝中，酪醇是酪氨酸代謝途徑的下游產物，是橄欖苦苷、羥基酪醇、紅景天苷等重要天然產物的關鍵前體。微生物中酪醇的合成途徑主要有3種：(1) SATOH等[2]在大腸桿菌中表達植物罌粟(Papaversomniferum)來源的酪氨酸脫羧酶(tyrosine decarboxylase，TDC)和藤黃微球菌(Micrococcusluteus)來源的酪胺氧化酶(tyramine oxidase，TYO)，并結合大腸桿菌內源的乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)，實現(xiàn)了酪醇的從頭合成，產量達到69 mg/L；(2) YANG等[3]在大腸桿菌中過量表達來源于釀酒酵母的苯丙酮酸脫羧酶(phenylpyruvate decarboxylase，ARO10)，得到了800.40 mg/L 酪醇；(3) CHUNG等[4]對擬南芥(Arabidopsisthaliana)、矮牽牛(Petuniahybrid)和荷蘭芹(Petroselinumcrispum)3種來源的芳香醛合成酶(aromatic aldehyde synthase，AAS)進行了檢測，發(fā)現(xiàn)表達PcAAS菌株的產量最高，達12.9 mg/L。在這3條途徑中，僅AAS可以將酪氨酸一步轉化為生產酪醇所需的直接前體物質。因此，本研究將從此途徑入手開展酪醇的生物合成研究。

ZHOU等[5-6]在大腸桿菌基因組中挖掘得到一系列梯度強度的組成型啟動子，并用于強化己二酸的生產。為了提升酪醇的產量，本研究以E.coliBL21 (DE3)為出發(fā)菌株，使用組成型啟動子PcspA[5]取代PT7啟動子，并運用該質粒過量表達PcAAS來構建酪醇合成的生物途徑。將調控分支代謝途徑基因敲除阻斷競爭途徑和過量表達乙醇脫氫酶來強化代謝流的方法結合起來，通過使用高、中、低3種不同強度的組成型啟動子對途徑中的關鍵酶AAS和ADH進行組合調控，實現(xiàn)了大腸桿菌合成酪醇的代謝途徑優(yōu)化。研究結果為后續(xù)采用發(fā)酵法生產酪醇和相關的下游產物奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒

本研究使用及構建的菌株和質粒分別見表1和表2。

表1 本研究使用的菌株

表2 本研究使用的質粒

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基F1(g/L)：葡萄糖 25.0，甘油 10.0，(NH4)2SO47.5，K2HPO4·3H2O 3.0，KH2PO42.0，MgSO4·7H2O 1.0，檸檬酸鈉 1.0，維生素B10.1，酵母粉 7.0，微量元素營養(yǎng)液1 mL/L，依據(jù)需求加入適量的抗生素。

微量元素營養(yǎng)液(g/L)：Al2(SO4)3·18H2O 2.0，CoSO4·7H2O 0.75，CuSO4·5H2O 2.5，H3BO30.5，MnSO4·H2O 24.0，NiSO4·6H2O 2.5，ZnSO4·7H2O 15.0。

酵母粉，Oxoid公司；胰蛋白胨及所有使用的抗生素粉末，上海生工有限公司；酪醇標準品，阿拉??；其余試劑購自國藥集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組編輯方法

基因組編輯方法參考JIANG等[9]的研究。敲除feaB基因(phenylacetaldehyde dehydrogenase gene)所用的sgRNA序列為5′-CGATCTTTGATCCGGCCACC-3′，其PAM序列為GGG，所用相關引物如表3所示。

表3 基因敲除使用的引物

1.2.2 重組質粒的構建方法

質粒構建相關引物如表4所示。質粒構建采用Gibson組裝的方法進行。首先通過簡單PCR獲得目的片段，對得到的PCR產物純化后使用Gibson組裝酶進行連接。將連接產物采用熱激法轉化E.coliJM109，次日挑取轉化子進行菌落PCR并將得到的陽性克隆進行Sanger測序。

表4 質粒構建使用的引物

1.2.3 搖瓶發(fā)酵方法

在LB平板上劃線分離得到單菌落，將其接種于LB培養(yǎng)基中并加入適量抗生素，在37 ℃，220 r/min的搖床中過夜培養(yǎng)(10～14 h)。以3%的接種量轉接至發(fā)酵培養(yǎng)基F1中，將裝有20 mL培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶置于30 ℃，220 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)，適時取樣。

1.2.4 樣品處理及HPLC檢測方法

由于酪氨酸微溶于水，利用酪氨酸的官能團—NH2和H+可進行化學反應這一特性，用2 mol/L的HCl將發(fā)酵液樣品按體積比2∶1稀釋，以確保酪氨酸完全溶解。用去離子水將發(fā)酵液樣品進一步稀釋，使最終產物濃度適宜分析方法的檢測范圍。稀釋完成后，12 000 r/min離心10 min。收集上清液并過濾處理得到用于HPLC測定的樣品。

HPLC測定的色譜柱為C18柱ODS-2 Hypersil(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測器的檢測波長為280 nm，A相為含有0.1%的三氟乙酸的去離子水，B相為含有0.1%三氟乙酸的乙腈，使用1.0 mL/min的流速進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫40 ℃， 進樣量10 μL。酪氨酸和酪醇的出峰時間分別約為10.0、12.5 min。

2 結果與分析

2.1 酪醇合成途徑的構建

本研究采用的代謝調控策略如圖1所示，選擇E.coliBL21 (DE3)作為出發(fā)菌株，利用化學轉化的方法將構建的重組質粒pRSFCP-P(攜帶有芳香醛合成酶PcAAS的基因)導入其中，得到菌株BL2101，以轉入空質粒pRSFDuet-1的菌株作為對照菌株(菌株BLCK)。結果表明，24 h時菌株BL2101發(fā)酵液中有酪醇產生，但隨著發(fā)酵時間的延長，產量并未有明顯增加，菌株BL2101的最終產量為105.97 mg/L。液相-質譜分析結果表明該產物為酪醇(圖2)。

圖1 本研究相關代謝工程策略示意圖

A-發(fā)酵24 h樣品及分析標準品液相檢測圖；B-從頭合成發(fā)酵產生的酪醇產量；C-發(fā)酵樣品質譜圖

2.2 分支代謝途徑的阻遏

酪醇合成依賴的莽草酸途徑是苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸以及相關衍生物合成的重要代謝途徑。下調支路表達可以有效增強流向產物的代謝流。首先，在缺失反饋抑制基因(transcriptional regulatory protein gene，tyrR)的菌株BER中轉入質粒pRSFCP-P獲得重組菌株BER01，酪醇產量為60.97 mg/L。在菌株BER的基礎上，繼續(xù)敲除在葡萄糖轉運過程中會使磷酸烯醇式丙酮酸轉變?yōu)楸岬幕騪tsG和crr(均為葡萄糖轉運過程相關基因)，并通過質粒過量表達PcAAS獲得的菌株BETR01，酪醇產量為76.24 mg/L。在此基礎上，敲除苯丙氨酸競爭途徑的基因pheA(prephenate dehydratase gene)以及會使磷酸烯醇式丙酮酸流向丙酮酸的基因pykF(pyruvate kinase)，并表達重組質粒pRSFCP-P獲得菌株BE01，其酪醇產量達131.22 mg/L，相比其他2株重組菌株，酪醇產量分別提升了115.22%及72.11%。另外，通過敲除會使代謝流流向副產物對羥基苯乙酸的基因feaB，并在該菌株中過量表達PcAAS獲得菌株BEKOF01，酪醇產量達到1 055.36 mg/L(圖3)。相比菌株BE01，酪醇產量提升了704.2%；相比在E.coliBL21 (DE3)中過量表達PcAAS，酪醇產量提升了896.23%。

A-feaB敲除電泳圖；B-基因缺失對酪醇產量的影響

2.3 乙醇脫氫酶的篩選

對羥基苯乙醛的還原反應是酪醇合成代謝途徑的最后一步，對酪醇生產具有重要影響。本研究利用大腸桿菌內源的乙醇脫氫酶實現(xiàn)該步反應，酪醇產量達到1 055.36 mg/L。為了深入研究乙醇脫氫酶活性對酪醇積累的影響，本研究考察了4種來源于大腸桿菌的乙醇脫氫酶(AdhE[10]、AdhP[11]、YahK[12]及FrmA[13])及1種來源于釀酒酵母的乙醇脫氫酶(Adh6)[14-15](圖4)。結果表明，過量表達大腸桿菌來源的乙醇脫氫酶效果不佳；過量表達FrmA僅獲得516.92 mg/L的酪醇；過量表達YahK僅產生了96.33 mg/L的酪醇；過量表達AdhE的菌株發(fā)酵液及過量表達AdhP的菌株發(fā)酵液并未檢測到酪醇；過量表達釀酒酵母來源的Adh6效果顯著(菌株BEKOF02)，酪醇產量達1 516.86 mg/L。 相比于未表達Adh6的菌株(菌株BEKOF01)，酪醇產量提升了43.73%。

A-乙醇脫氫酶篩選；B-酪醇產量

2.4 關鍵酶PcAAS和ScADH6的組合調控

酶表達量的調節(jié)是代謝工程改造過程中的重要方法。在本研究中，通過調整質粒拷貝數(shù)的方法，嘗試平衡酪醇生產的代謝流。質粒pRSFDuet-1、pETDuet-1、pACYCDuet-1和pCDFDuet-1含有的復制子分別是RSF、pBR322、p15A和CDF，其拷貝數(shù)分別為100、40、20和10[16]。由于本研究已使用pRSFDuet-1作為載體，因此將PcAAS及ScADH6的表達框克隆至其余3個質粒中，獲得菌株BEKOF-pET、BEKOF-pACYC及BEKOF-pCDF。3株菌株產量均低于50.00 mg/L (圖5、表5)。

因此，為了進一步優(yōu)化代謝流，選擇具有不同表達強度的啟動子PyjeFE(低強度)、PcspA(中強度)、Pinfc-rplT(高強度)[5]分別用于調節(jié)PcAAS及ScADH6的表達強度。結果表明，A2B1(使用啟動子PcspA表達PcAAS，啟動子PyjeFE表達ADH6)的組合產量較BEKOF02(使用啟動子PcspA表達PcAAS，啟動子PcspA表達ADH6)產量提升了293.60 mg/L，酪醇產量達到1 810.46 mg/L(圖5、表5)。

表5 復制子或啟動子對酪醇產量的影響

A-酪醇產量；B-復制子篩選；C-啟動子組合表達篩選

2.5 最佳菌株BEKOF-A2B1的發(fā)酵優(yōu)化

葡萄糖和甘油是大腸桿菌培養(yǎng)過程中常用的碳源，在細胞生長過程中發(fā)揮著重要作用。此外，葡萄糖和甘油也是細胞糖酵解途徑的底物，其含量的高低直接決定了代謝所產生的產物含量。本研究中的出發(fā)培養(yǎng)基中含有葡萄糖25 g/L及甘油10 g/L，以此為基礎，進行了葡萄糖和甘油濃度的調整。圖6表明了不同配比下發(fā)酵60 h時酪醇的產量、菌體OD600以及發(fā)酵液pH。25 g/L葡萄糖和20 g/L甘油的組合具有優(yōu)勢(圖6-A)，但發(fā)酵液pH較低，導致大腸桿菌難以進行正常的代謝活動。因此，通過提高培養(yǎng)基中氮源濃度的方法或外源添加來調節(jié)發(fā)酵過程中的pH，結果表明外源添加5 g/L碳酸鈣效果最佳，酪醇產量達到2 120.58 mg/L。

A-碳源濃度優(yōu)化；B-氮源濃度優(yōu)化及CaCO3濃度優(yōu)化

3 討論

酪醇因具有顯著的抗氧化、抗腫瘤等功能藥效成為近年來的研究熱點[17]。釀酒酵母由于具有完整的Ehrlich途徑，成為研究者們較為青睞的表達宿主。但是，由于較長的發(fā)酵周期使得釀酒酵母作為生產菌株具有了一定的局限性，如LIU等[18]改造的對香豆酸生產菌株1個發(fā)酵周期需要96 h，GUO等[19]改造獲得的具有酪醇生產能力的釀酒酵母的發(fā)酵周期為196 h。大腸桿菌因發(fā)酵周期較短且易于基因工程改造等優(yōu)點成為了另一種選擇。研究表明，在宿主細胞中表達來源荷蘭芹的芳香醛合成酶可以構建酪醇生物合成途徑[4,19-20]。本研究將經(jīng)密碼子優(yōu)化的PcAAS在E.coliBL21 (DE3)中過量表達，酪醇產量達到105.97 mg/L。此外，在缺失了不同分支代謝途徑調控基因的菌株中過量表達PcAAS，以及敲除對酪醇積累具有顯著抑制作用的feaB基因，酪醇積累量達到1 055.36 mg/L，而未缺失feaB基因的菌株產量僅為131.22 mg/L，研究結果與此前的報道類似[3, 13, 21]。

在多數(shù)研究中，醛基到羥基的還原反應依賴于大腸桿菌中天然存在的醇脫氫酶[4, 13]。過量表達乙醇脫氫酶可以強化酪醇合成途徑的代謝流。GUO等[20]在釀酒酵母中表達來自大腸桿菌的乙醇脫氫酶，提高了酪醇的產量。本研究過量表達ScADH6使得酪醇的產量由1 055.36 mg/L提高至1 516.86 mg/L。另外，LIU等[18]通過同時優(yōu)化生物合成途徑中關鍵酶的啟動子，顯著提高了對香豆酸的產量。在本研究使用中等強度啟動子啟動PcAAS與低強度啟動子啟動ScADH6的組合表現(xiàn)出較大潛力，酪醇產量達1 810.46 mg/L。 在此基礎上，通過優(yōu)化碳氮源初始濃度以及加入CaCO3改善發(fā)酵過程pH穩(wěn)定性，酪醇產量提高至2120.58 mg/L。在搖瓶發(fā)酵水平上，較XU等[13]研究中大腸桿菌YMG5A*R的產量1 506.96 mg/L及LIU等[22]研究中釀酒酵母LYTY16的產量702.30 mg/L，酪醇分別提升了40.72%和201.95%。但是，在發(fā)酵罐水平上，對比XU等[13]研究中的3.90 g/L和LIU等[22]研究中的9.90 g/L，仍存在一定差距。因此，在后續(xù)研究中，可以結合對前體供給途徑的系統(tǒng)改造和發(fā)酵過程優(yōu)化，使其成為羥基酪醇等高價值化合物合成的良好平臺菌株。