尹延順,姜欣,宋濤,孟君，張林，董建輝，皇甫潔,馮婧,楊親正,李紅*

1(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物工程學(xué)院，山東 濟(jì)南，250353)2(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 3(國(guó)家酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，北京，100015)4(株洲千金藥業(yè)股份有限公司千金研究院，湖南 株洲，412000)

果酒是以果實(shí)為原料，經(jīng)過(guò)破碎、壓榨取汁、發(fā)酵或者浸泡等工藝釀制而成的一種含有酒精的飲品。生產(chǎn)果酒不僅能解決水果生產(chǎn)過(guò)剩、銷售難的困境，還能提高原料的附加值，增加果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收益。目前果酒市場(chǎng)種類繁多，常見的除葡萄為原料外，還有蘋果、棗、柑橘等[1-3]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)果酒的質(zhì)量提出了更高要求，兼?zhèn)涓郀I(yíng)養(yǎng)價(jià)值和美好風(fēng)味的果酒日益受到廣大消費(fèi)者的青睞。通過(guò)使用木瓜，香蕉和西瓜生產(chǎn)混合果酒，改善了果酒的理化和感官特性[4]；TSEGAY等[5]通過(guò)添加馬纓丹果汁使果酒中總酚含量和感官值顯著提高。

果酒成分中的揮發(fā)性化合物在決定感官質(zhì)量方面起著關(guān)鍵作用，當(dāng)然也會(huì)影響消費(fèi)者的偏好[6]。果酒的香氣受多種因素控制，如水果類型、品種、氣候、酵母菌株和釀酒程序[7]。揮發(fā)性化合物的最終組合將定義果酒的特征香氣，并且將在根據(jù)其質(zhì)量區(qū)分果酒方面發(fā)揮重要作用。事實(shí)上，一些特定的揮發(fā)性化合物可能與不同品種果酒的獨(dú)特特征有關(guān)，例如，辛酸、大馬士革烯酮和乙酸異戊酯構(gòu)成了櫻桃酒的獨(dú)特品質(zhì)[8]。

許多方法能檢測(cè)分析果酒復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)，如同時(shí)蒸餾萃取法、頂空固相微萃取法(headspace solid-phase micro extraction, HS-SPME)、攪拌棒吸附萃取法、吹掃捕集法等[9]。HS-SPME是一種快速、靈敏、無(wú)溶劑的方法，廣泛應(yīng)用于提取蔬菜和水果的香氣[10]，和其他樣品處理方法相比,具有操作簡(jiǎn)便、測(cè)試迅速, 不需有機(jī)溶劑，集樣品萃取、濃縮為一體等優(yōu)點(diǎn),其常與GC-MS一起使用測(cè)定果酒中的揮發(fā)性成分。

偏最小二乘法(partial least squares regression, PLSR)基于高維投影思想，通過(guò)提取主成分的方法對(duì)系統(tǒng)中的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行分解和篩選，實(shí)現(xiàn)對(duì)系統(tǒng)解釋性最強(qiáng)的綜合變量的有效抽??；PLSR可進(jìn)行樣本量小、變量間存在多重相關(guān)性的數(shù)據(jù)處理[11]，常用于感官屬性與揮發(fā)性化合物關(guān)系的模型建立。陳義等[12]采用PLSR對(duì)信陽(yáng)毛尖中的香氣成分與感官之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，有效確定了信陽(yáng)毛尖香氣的等級(jí)劃分。牛云蔚等[13]通過(guò)PLSR對(duì)不同產(chǎn)地櫻桃酒中特征呈味物質(zhì)與感官屬性之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明感官屬性與部分特征呈味物質(zhì)顯著相關(guān)。

雖然人們對(duì)果酒中揮發(fā)性物質(zhì)的提取和鑒定進(jìn)行了大量的研究，但對(duì)儀器分析與感官評(píng)定之間的關(guān)系以及復(fù)合果酒與單一果酒的比較研究較少。本研究旨在探索和表征單一果酒和復(fù)合果酒的化學(xué)成分和感官特性。文章研究了風(fēng)味成分與感官特性之間的關(guān)系，并對(duì)感官特性的影響因素進(jìn)行了探討。將為復(fù)合果酒風(fēng)味特征研究及產(chǎn)品的開發(fā)和推廣提供有價(jià)值的參考信息。

1 材料與方法

1.1 果酒樣品

從市場(chǎng)購(gòu)買了4種含有相同原料葡萄的果酒樣品，包括W1、W2、W3三種復(fù)合果酒和W4 單一型果酒。通過(guò)添加額外水果探究對(duì)其果酒風(fēng)味成分和感官的影響。果酒的描述和編號(hào)如表1所示。

表1 研究中使用的果酒說(shuō)明

1.2 儀器與設(shè)備

ICS-3000離子色譜系統(tǒng)，美國(guó)Dionex公司；MPS-2自動(dòng)進(jìn)樣器，德國(guó)Gerstel公司；聚四氟乙烯硅隔板，英國(guó)Chromacol公司；IKA RCT堿性磁力攪拌器，德國(guó)Werke GmbH公司；島津GC-2010氣相色譜儀、MS-QP 2010 Plus質(zhì)譜儀，日本島津公司。

1.3 果酒質(zhì)量參數(shù)分析

每個(gè)樣品的pH值由pH計(jì)測(cè)量。可滴定酸度(titratable acid，TA)測(cè)定為0.1 mol/L NaOH滴定至pH=8.2為其終點(diǎn)，并以酒石酸(g/L)表示。有機(jī)酸的鑒定/分析采用ICS-3000離子色譜系統(tǒng)。采用Ionpac AS11-HC型分離柱(250 mm×4 mm) 和Ionpac AG11-HC型保護(hù)柱(50 mm×4 mm)， 樣品體積為25 μL，通過(guò)與已知純化合物的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.99)進(jìn)行鑒別和定量。所有樣品分析一式三份。

1.4 HS-SPME

使用MPS-2自動(dòng)進(jìn)樣器提取揮發(fā)性芳香化合物。在250 ℃的氣相色譜進(jìn)樣口對(duì)SPME纖維進(jìn)行1 h的預(yù)處理。在對(duì)纖維涂層、提取時(shí)間、提取溫度和樣品體積/頂空體積比進(jìn)行深入優(yōu)化后，將4 mL樣品轉(zhuǎn)移到15 mL的SPME玻璃小瓶中。隨后添加2-辛醇內(nèi)標(biāo)溶液(5 μL，104.46 mg/L)和NaCl(1.0 g)，用聚四氟乙烯硅隔板蓋住小瓶，用IKA RCT堿性磁力攪拌器在40 ℃下以120 r/min 攪拌樣品20 min，平衡揮發(fā)性化合物，然后在相同溫度和攪拌下提取30 min。將纖維立即插入氣相色譜進(jìn)樣口，在250 ℃下解吸揮發(fā)物8 min。

1.5 GC-MS

解吸后的揮發(fā)性化合物在氣相色譜儀中分離，該儀器配備有DB-5毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)和MS-QP 2010 Plus質(zhì)譜儀。載氣為氦氣，流速為1 mL/min， 裂解比為1∶2。氣相色譜烘箱溫度條件為：40 ℃烘3 min，3 ℃/min升至165 ℃，保持1 min，10 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

MS系統(tǒng)中傳輸線、四極和電離源的溫度分別為280、150、230 ℃；在70 eV電離電壓下記錄電子碰撞質(zhì)譜。采集以全掃描模式(30～350 amu)進(jìn)行。

1.6 感官分析

感官評(píng)價(jià)在中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院感官實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用定量描述感官評(píng)價(jià)法對(duì)果酒樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)小組由10名專業(yè)品評(píng)成員(均有1年以上酒類品評(píng)經(jīng)驗(yàn))組成，4 名男性和6名女性，年齡在28～45歲。評(píng)價(jià)人員根據(jù)ISO4121標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了培訓(xùn)，分別對(duì)4款果酒的 8種感官屬性進(jìn)行評(píng)價(jià)，包括花香、果香、麥芽香、辛辣味、乳酸味、乙酸味、甜味和苦味(表2)；呈味強(qiáng)度采用5分制打分(0分表示沒有味道，5分表示味道最強(qiáng))，記錄各評(píng)價(jià)人員的評(píng)價(jià)打分結(jié)果。每個(gè)樣品在不同日期重復(fù)評(píng)價(jià)3次。

表2 感官屬性及相應(yīng)參考標(biāo)準(zhǔn)一覽表

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均表示為3次平行的平均值。數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0。經(jīng)方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.05)。使用The Unscrambler X 10.4進(jìn)行PLSR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果酒質(zhì)量參數(shù)分析

4種果酒樣品的有機(jī)酸成分如表3所示，酒精含量如表1所示。對(duì)影響果酒質(zhì)量的TA、pH和有機(jī)酸進(jìn)行了分析。所有變量在樣本間均有顯著性差異(P<0.05)。 果酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)為11%～12%，pH值為3.26～3.52。酒精含量和pH值的差異已被證明會(huì)影響人們對(duì)果酒中某些香氣的感知。TA為4.90～ 7.91 g/L，W2最高，W4最低，但是整體之間差距并不大，本研究中選用相近基本理化指標(biāo)的樣品可降低其他因素對(duì)最終香氣的影響。

表3 四種果酒中的有機(jī)酸成分

酸度被認(rèn)為是果酒的基本要素，應(yīng)該足以給最終產(chǎn)品帶來(lái)干凈、清爽的印象[14]。在4種果酒中檸檬酸和蘋果酸含量最高，乙酸含量也較高，W3的乙酸含量明顯高于其他樣品，達(dá)到了2.96 g/L。蘋果酸在蘋果酸乳酸發(fā)酵過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)化為乳酸，通過(guò)將蘋果酸轉(zhuǎn)化為乳酸，減少生果酒的酸澀和粗糙感，使得果酒的口感更加柔和、圓潤(rùn)。乳酸和蘋果酸的含量可以用來(lái)指示葡萄酒中蘋果酸乳酸發(fā)酵的程度[15]。W3中乳酸含量較高，說(shuō)明其蘋果酸-乳酸發(fā)酵過(guò)程較好。檸檬酸可以用來(lái)調(diào)節(jié)酒類產(chǎn)品的酸度，其中以W2的含量最高。W2變酸可能是檸檬酸所致。

2.2 不同果酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的鑒定與表征

果酒樣品中檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分如表4所示。所有這些化合物均根據(jù)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了表征。經(jīng)初步鑒定，共有15種化合物為風(fēng)味物質(zhì)成分，包括8種醇、4種醛、縮醛、酮和3種酯。W3(826.68 mg/L)和W1(548.6 mg/L)的總風(fēng)味物質(zhì)成分含量分別最高和最低。

表4 四種果酒風(fēng)味物質(zhì)成分及含量 單位：mg/L

2.2.1 醇分析

酵母發(fā)酵導(dǎo)致形成許多醇，也稱為雜醇，主要由C3～C5直鏈醇，支鏈醇和苯基醇組成，它們產(chǎn)生于氨基酸的脫羧和脫氨基以及糖的分解代謝[16]。據(jù)報(bào)道，氨基酸的組成取決于釀酒原料。因此，這些揮發(fā)性化合物與所用原料有關(guān)[17]。這些果酒中醇的含量從 410.4 mg/L(W1)～557.05 mg/L(W3)。對(duì)于單個(gè)醇，甲醇和異戊醇是所有果酒樣品中發(fā)現(xiàn)的最多的，尤其是在W4和W3中。其次是異丁醇和正丙醇。

2.2.2 醛、縮醛和酮分析

醛類、縮醛和酮類的含量相對(duì)較低，例如，這些化合物的含量在不同果酒中分別為28.4～106.34 mg/L。盡管它們的含量很低，但這些化合物與其他化合物結(jié)合，可能會(huì)產(chǎn)生奇妙的芳香，有助于增強(qiáng)整體芳香的復(fù)雜性和平衡性[18]。主要醛類為乙醛，特別是在W2(72.5 mg/L)中?？啡﹥H在W2中被檢測(cè)出來(lái)。

2.2.3 酯分析

在本研究中，不同果酒中酯的總含量差別較大，為70.2 mg/L(W2)～230.2 mg/L(W4)。對(duì)于單個(gè)酯，在總酯中W4乳酸乙酯含量最高，為174.4 mg/L。在這些果酒中同時(shí)還檢測(cè)到了丁二酸二乙酯、乙酸乙酯，據(jù)報(bào)道，這些酯屬于發(fā)酵性化合物[19]，尤其是乙酸乙酯，它似乎是許多品種的重要香氣成分。由發(fā)酵過(guò)程中酵母產(chǎn)生的酰基輔酶A形成的乙酸酯和乙酯，為果酒提供了獨(dú)特的水果和植物香味[20]。

2.3 不同果酒中的活性氣味劑

果酒中存在大量的芳香揮發(fā)性化合物，其風(fēng)味強(qiáng)度取決于濃度和閾值[21-22]。盡管不同香氣成分之間可能發(fā)生相互作用，但只有有限數(shù)量的氣味活性值(odor activity values，OAV)>1的揮發(fā)物可以被視為香氣貢獻(xiàn)者以及活性氣味劑[23-25]。如表5所示，計(jì)算了14種揮發(fā)性化合物的OAV，根據(jù)從參考文獻(xiàn)中獲得的每種香氣的氣味閾值，在所調(diào)查的14種揮發(fā)性化合物中，有11種化合物OAV>1。

表5 根據(jù)氣味閾值測(cè)定果酒中揮發(fā)性香氣化合物的OAV

醇類和醛酮類化合物是果酒活性香氣的主要來(lái)源。與其他果酒相比，在W4(8 295.7 mg/L)中獲得的醇值最高，其次是W1和W2(5 137.3～5 343.9 mg/L)。β-苯乙醇和甲醇是活性最強(qiáng)的醇。其中，β-苯 乙醇在所有觀察到的果酒中值都較高，特別是在W4(6 292.5 mg/L)中。此外，果酒的香氣也主要來(lái)自醛酮類，尤其是乙醛(800.0～2 900.0 mg/L)。相比之下，高濃度和高閾值的酯對(duì)果酒香氣的貢獻(xiàn)較小(OAV<2)。

2.4 感官分析

對(duì)果酒感官評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，不同果酒樣品的8種感官指標(biāo)均存在顯著差異(P<0.05)。圖1為不同果酒感官特性分析雷達(dá)圖，總體來(lái)看，復(fù)合型果酒(W1，W2，W3)比單一型果酒(W4)的香氣更為豐富、濃郁。4款果酒在花香、甜味、乙酸味和乳酸味差異較大；而在果香、辛辣味和麥芽香幾個(gè)感官特性上差異較小。花香、果香和甜味在W1和W2中更突出，而W3中的乳酸味、乙酸味和苦味較為突出。

2.5 感官屬性與化學(xué)成分的相關(guān)性

PLSR分析研究了感官屬性(Y矩陣)和揮發(fā)性化合物(X矩陣)之間的關(guān)系[26-27]。在本研究中，87%的X方差(揮發(fā)性化合物)和82%的Y方差(感官屬性和樣品)可以在PLSR模型中得到解釋(圖2)。圖2-b展示了相關(guān)載荷圖，其中內(nèi)橢圓表示50%的解釋方差，而外橢圓表示100%的解釋方差。大多數(shù)感官描述和揮發(fā)性化合物位于2個(gè)橢圓形之間的圖形中，根據(jù)之前的一項(xiàng)研究，內(nèi)橢圓形內(nèi)的化合物建模不佳，無(wú)法解釋感官數(shù)據(jù)的變化[28]。位于2個(gè)橢圓形之間的感官描述符和揮發(fā)性化合物表明，可以用PLSR模型很好地解釋兩者之間的相關(guān)性。

a-果酒PLSR評(píng)分曲線；b-香氣成分和感官屬性的相關(guān)載荷圖

W3位于PC1正值和PC2正值處，它的特征是具有乳酸味、乙酸味、苦味和麥芽香的感官特性，與圖1中得分最高的感官評(píng)價(jià)結(jié)果一致，這4種氣味描述并與乙醛、正丁醇、正丙醇和異戊醇等揮發(fā)性化合物有關(guān)。W2位于PC1正值和PC2負(fù)值處，它的特征是具有花香、果香和甜味的感官特性，并與糠醛、異丁醇等揮發(fā)性化合物有關(guān)，這一結(jié)果與和先前的研究結(jié)果一致[29]。然而，W1的感官描述與揮發(fā)性成分之間的相關(guān)性較弱，可能是受復(fù)雜成分的影響，有待進(jìn)一步研究。

圖1 果酒感官屬性強(qiáng)度的雷達(dá)圖

3 總結(jié)

本研究采用HS-SPME和GC-MS分析，對(duì)含有相同原料的3種復(fù)合果酒和一種單一果酒的香氣成分進(jìn)行了表征。共鑒定出15種揮發(fā)性化合物，其中大部分高濃度的化合物來(lái)源于不同的發(fā)酵過(guò)程，如醇類、乙酯類。此外，還計(jì)算了14種量化揮發(fā)性化合物的OAV，并測(cè)定了11種可能造成影響的氣味劑(OAV>1)。感官屬性的強(qiáng)度由專業(yè)評(píng)估人員完成，與單一果酒W4相比，復(fù)合果酒W1、W2、W3的香氣更濃郁、更豐富。在PLSR模型中，對(duì)W2和W3的香氣特征進(jìn)行了識(shí)別和呈現(xiàn)。相比之下，W4沒有發(fā)現(xiàn)明顯的特征。這些結(jié)果表明，復(fù)合果酒比單一果酒具有更豐富的香氣特征。本研究對(duì)復(fù)合果酒中的關(guān)鍵香氣成分進(jìn)行了深入的探討。PLSR可以用來(lái)描述果酒的香氣成分與感官特性之間的關(guān)系。