黃慶華 謝浩東 孫世平 孫守禮 崔寧 許傳田 成炳才 李文峰 李建和 李超

摘 要：禽流感（avian influenza， AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）引起的一種以侵害呼吸系統(tǒng)為主的疾病，是集約化養(yǎng)雞場的重要疫病之一。本研究分別建立H9N2亞型AIV感染MDCK細胞和雞胚模型，探討研發(fā)的中獸藥復方制劑對H9N2 AIV的抑制作用。結果顯示，中獸藥復方制劑具有良好的安全性，制劑原液和各個稀釋度對雞胚基本沒有毒性，制劑原液（200 mg/mL）稀釋102倍至2 mg/mL以下對體外培養(yǎng)的MDCK細胞基本無毒性;制劑原液（200 mg/mL）稀釋104倍至0.02 mg/mL均能有效抑制H9N2 AIV在雞胚中的增殖，稀釋105倍至0.002 mg/mL仍然對H9N2 AIV在MDCK細胞上的復制具有良好的預防和治療效果，且預防效果優(yōu)于治療效果。結果表明本研究制備的中獸藥復方具有良好的抗H9N2 AIV效果。

關鍵詞：中獸藥復方;H9N2 AIV;MDCK;雞胚

中圖分類號：S853.9 文獻標識碼：B文章編號：1673-1085（2021）9-0005-07

流感病毒（influenza virus， IV）為RNA病毒，基因組由8條單股負鏈RNA構成，每個片段編碼一種或兩種蛋白質。表面糖蛋白血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）是將甲型流感病毒分為亞型的基礎[1]。根據病毒HA和NA的抗原性差異，AIV可劃分為18個HA亞型和11個NA亞型。H9N2亞型禽流感（avian influenza， AI）是由H9N2亞型禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）引起的一種禽類病毒性傳染病，被認為是集約化養(yǎng)雞場的重要疫病之一，該病廣泛分布于世界各地，威脅著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，常常造成嚴重的經濟損失[2， 3]。據統(tǒng)計，1996～2000年間，H9N2 AIV感染的雞群占93.89%，這表明從19世紀末到20世紀初，H9N2是影響家禽養(yǎng)殖的主要亞型。直到今天，除了臭名昭著的H5N1和新興的H7N9新秀之外，H9N2仍然是破壞家禽業(yè)的三種主要AI亞型之一?？梢哉f，H9N2 AIV是全球家禽群體中檢測到的最常見的流感病毒亞型[4]。

單純H9N2 AIV疫苗不能100%控制發(fā)病，養(yǎng)殖場生物安全不到位，或者飼養(yǎng)管理操作不當，都會給雞群造成一定的應激，就有可能導致禽流感爆發(fā)。同時由于病原不斷產生變異，流感疫苗研發(fā)的速度往往跟不上病原變異速度，導致許多養(yǎng)殖場雖然免疫了疫苗，偶爾還會爆發(fā)禽流感[5]。近期，臨床上出現(xiàn)許多呼吸道癥狀的家禽病例，剖檢可見雞喉頭栓塞和氣管環(huán)出血，通過實驗室病毒分離和分子生物學檢測鑒定為H9N2 AIV和其他病原如傳染性支氣管炎、支原體等的混合感染導致，進一步加重流感病情[6]。家禽病毒病在臨床中發(fā)生后，沒有特效的藥物療法，發(fā)病后及時采用對癥進行治療可顯著減低動物死亡率。雖然在生產過程中適當添加抗生素可以在一定程度上降低該病病癥，但應用抗生素主要是針對病毒感染引起的并發(fā)癥，而且隨著大量抗菌藥特別是廣譜抗菌藥在養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應用，抗菌藥物的耐藥性問題日趨突出[7]。我國自然資源十分豐富，中草藥的使用歷史可以追溯到人類文明的起源，中獸藥及其副產品無疑將成為我國抗生素替代品開發(fā)得天獨厚的資源。中藥具有靶點多、種類多、成本低、耐藥性低、副作用小等獨特優(yōu)勢，有望在對抗AIV的過程中發(fā)揮重要作用[8]。

針對以上情況，山東省農業(yè)科學院家禽健康養(yǎng)殖產業(yè)技術研究院研發(fā)了一種針對家禽病毒病尤其是對呼吸系統(tǒng)疾病有抑制作用的中獸藥復方制劑。本研究在MDCK細胞和雞胚中評價該中獸藥組方抗H9N2 AIV的作用，旨在為新藥研發(fā)和臨床應用提供試驗依據。

1 材料

1.1 測試藥物

山東省農業(yè)科學院家禽健康養(yǎng)殖產業(yè)技術研究院研發(fā)中獸藥復方，主要由板藍根、金銀花、魚腥草、甘草等9種中藥組成，由銀翹散、麻杏石甘湯、二陳湯加減，根據家禽生理特點，氣管長痰液不易咳出，加強了化痰、平喘、控制炎性滲出藥物;易出現(xiàn)肺炎、肺壞死、黑肺、肺纖維化、支氣管栓塞等肺部病變，加強潤肺瀉肺藥物;腎為生痰之根，脾為生痰之源，培土生金，補水潤金，添加健脾補腎利濕藥物。用傳統(tǒng)水提法將中藥復方熬制成1 mL含200 mg生藥的藥液（即200 mg/mL），用0.22 μm濾膜過濾除菌，以此為待測藥物初始濃度。

1.2 細胞株

MDCK細胞由山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控團隊病原生態(tài)學方向保存，生長液為含有5% FBS的DMEM，培養(yǎng)條件37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱。

1.3 病毒株

H9N2 AIV流行株A/Chicken/Shandong/903（CK/SD/903）由山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病防控團隊病原生態(tài)學方向分離純化和保存。

1.4 雞胚

SPF雞胚購自山東省農業(yè)科學院家禽研究所SPF雞場，在本研究室孵化至10日齡。

1.5 雞紅細胞懸液

1%雞紅血球由本研究室采集成年公雞血液制備，用于收獲的病毒液HA測定。

1.6 主要試劑、耗材和儀器

試劑包括DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、青霉素（80 IU）、鏈霉素（100 IU）、無菌PBS等。耗材和儀器包括吸管、小試管、微量移液器、細胞培養(yǎng)箱、酶標儀等。

2 方法

2.1藥物對細胞毒性的測定

將MDCK細胞接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)，待細胞剛鋪滿單層，將藥物用DMEM進行10倍倍比稀釋，從10-1稀釋到10-5共5個稀釋梯度;用PBS（含雙抗）溶液輕輕洗滌96孔板中的MDCK細胞3次，每孔100 μL;將不同稀釋度藥物加入細胞，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)3～5 d，利用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖，評價藥物對MDCK細胞的毒性。

2.2藥物對雞胚的安全性評價

將藥物用PBS（含雙抗）進行10倍倍比稀釋，從原液稀釋到10-2共3個稀釋梯度;按照100 μL/胚的劑量接種10日齡SPF雞胚，去掉24 h以內死亡的雞胚，記錄雞胚死亡情況，并在5 d后觀察雞胚發(fā)育情況，評價藥物對雞胚的安全性。

2.3 H9N2 AIV組織半數(shù)感染量（TCID50）測定

將MDCK細胞接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)，待細胞剛鋪滿單層，將H9N2 AIV用PBS（含雙抗）進行10倍倍比稀釋，從10-1稀釋到10-11共11個稀釋梯度;用PBS（含雙抗）溶液輕輕洗滌96孔板中的MDCK細胞3次，每孔100 μL;將稀釋完的病毒依次接種到鋪滿單層MDCK細胞的96孔板中，每孔100 μL，每個病毒稀釋梯度4個重復，96孔板第12排孔作為陰性對照，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h;吸棄96孔板中的病毒液，加100 μL PBS（含雙抗）洗滌一次，棄掉洗液后每孔加入200 μL含2 μg/ml TPCK-treated 胰酶的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h;用1%紅細胞測檢測細胞上清血凝效價，按Reed-Muench法計算TCID50。

2.4H9N2 AIV雞胚半數(shù)感染量（EID50）測定

將H9N2 AIV用PBS（含雙抗）進行10倍倍比稀釋，從10-5稀釋到10-10共6個稀釋梯度，接種10日齡SPF雞胚，每個稀釋度接5枚雞胚，每胚100 μL，去掉24 h以內死亡的雞胚，在5 d后收集尿囊液測定病毒效價，按Reed-Muench法計算EID50。

2.5 藥物在MDCK細胞上抗H9N2 AIV效果評價

根據測定的TCID50建立H9N2 AIV感染MDCK細胞模型，進行抗病毒效果評價。鋪板MDCK細胞，待細胞長至80%，分為預防和治療2個組：預防組為先在細胞中加入不同濃度中藥，12～24 h接種病毒;治療組為先接種病毒，吸附2 h后加入不同濃度中藥。培養(yǎng)3～5 d后測定細胞上清中的血凝效價。

2.6藥物在雞胚內抗H9N2 AIV效果評價

根據測定的EID50建立H9N2 AIV感染雞胚模型，進行抗病毒效果評價。將藥物分別進行10倍倍比稀釋后，與H9N2 AIV進行等量混合，按照200 μL/胚的劑量接種10日齡SPF雞胚。去掉24 h以內死亡的雞胚，記錄雞胚死亡情況，在5 d后收集尿囊液測定病毒血凝效價，并觀察雞胚發(fā)育情況。

3 結果與分析

3.1 藥物對MDCK細胞毒性測定結果

測定結果見圖1。藥物對MDCK細胞毒性作用表現(xiàn)為細胞折光性增加，細胞變圓、粘連、脫落、破碎，吸光值明顯下降。由圖1可知，該中藥液進行10倍稀釋對細胞毒性很大，存活細胞很少，進行102倍以上稀釋未見明顯的細胞毒性，進行104和105倍稀釋對細胞增殖有一定的促進作用。即該中獸藥復方制劑對MDCK細胞的最大安全濃度為2 mg/mL。

3.2 藥物對雞胚安全性評價

安全性試驗結果見圖2。與空白對照組雞胚

（圖2 D）相比，制備的中獸藥制劑原液（圖2 A）以及經過10倍（圖2 B）和102倍（圖2 C）稀釋后使用，均不影響雞胚發(fā)育，雞胚均無死亡。由此可見，該中獸藥復方制劑在200 mg/mL的劑量范圍內均具有很好的安全性，對雞胚基本沒有毒性。

3.3 藥物抑制H9N2 AIV在MDCK細胞上增殖

按照藥物對MDCK細胞毒性測定結果，該中獸藥制劑進行102倍以上稀釋無細胞毒性。因此在MDCK細胞上進行藥物抗H9N2 AIV作用評價研究需要將藥物稀釋102倍至2 mg/mL以上，結果見圖3。在預防組中，即先加入藥物后接種病毒，藥物稀釋104倍和105倍對病毒的預防效果分別為100%和66.7%，差異均顯著（圖3-Prevention）。在治療組中，即先接種病毒后加入藥物，在病毒吸附2 h后，藥物稀釋104倍接種MDCK細胞，藥物對病毒增值的抑制率為66.7%，差異顯著;病毒吸附2 h后，藥物稀釋105倍，接種MDCK細胞，仍然能夠在一定程度上抑制病毒增值，抑制率為31.25%（圖3-Treat）。結果表明該中獸藥復方對H9N2 AIV的預防和治療效果均良好。

3.4 藥物抑制H9N2 AIV在雞胚內增殖

結果如圖4和表1所示，該中獸藥制劑原液200 mg/mL進行101、102、103、104倍稀釋后均能夠有效控制H9N2 AIV在雞胚中的復制，對雞胚的保護率為100%，同時雞胚發(fā)育良好，進一步說明該中獸藥復方制劑具有良好的抗H9N2 AIV效果和安全性。

4 討論與結論

本研究發(fā)明的中獸藥復方組方科學嚴謹，在古人傳統(tǒng)方劑基礎上根據家禽生理特點和發(fā)病規(guī)律做適當加減或藥效加強，理論上可以治療多數(shù)由病毒性疾病和病原菌引起的呼吸系統(tǒng)疾病，H9N2 AIV引起的禽流感是造成家禽呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原，它可以在MDCK細胞系和雞胚中進行有效增殖[1]，所以本研究建立H9N2 AIV感染MDCK細胞和雞胚模型，并進一步評價了該中獸藥復方對H9N2 AIV的抑制作用，旨在為呼吸系統(tǒng)新藥研發(fā)和臨床應用提供試驗依據。

本研究首先評價該中獸藥復方制劑對MDCK細胞的毒性作用和對雞胚的安全性，結果表明，制備的中獸藥制劑原液（200 mg/mL）進行102倍以上稀釋后對細胞基本無毒性，103倍以上稀釋后對細胞無毒性，中藥液原液、10倍和102倍稀釋后使用均不影響雞胚發(fā)育，雞胚均無死亡。由此可見，該中藥復方具有很好的安全性，對雞胚基本沒有毒性，但進行細胞水平研究時需要進行至少102倍以上稀釋。綜合細胞和雞胚的數(shù)據，該中藥復方藥物毒性很低，在臨床應用時進行102倍以上稀釋達到2 mg/mL的劑量可保證雞群的安全性。細胞試驗同時表明本研究實驗方法制備的提取液對細胞有一定的毒性，這是中藥普遍面臨的問題[9， 10]，如何去除中藥中有細胞毒性的成分以獲得理想的有效抗病毒成分仍有待于深入研究。

本中獸藥復方是由板藍根、金銀花、魚腥草、甘草等多種中藥組方提取而成，里面的抗病毒藥如板藍根，在臨床上應用廣泛，具有抗菌、抗病毒的作用，可直接與流感病毒表面的血凝素結合，抑制流感病毒的活性[11]，板藍根含板藍根總生物堿、靛玉紅、落葉松樹脂醇B、葡萄糖苷等活性成分，直接抑制流感病毒的核輸出，通過抑制病毒介導的 NF-κB 通路的活化，抑制流感病毒誘導的炎癥因子達IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1， IP-10等的釋放[12， 13]，其中的α-葡聚糖還能通過提高體液免疫和細胞免疫功能增強機體抗病毒能力[14]。金銀花含木犀草苷、木犀草素等活性成分，對活化的NF-κB信號通路進行正負反饋調節(jié)，減輕炎性損傷作用，同時影響TLR信號通路及凋亡相關因子表達[15， 16]。魚腥草和甘草含槲皮素等活性成分，通過與流感血凝素蛋白相互作用，抑制病毒與細胞融合[17]。本研究中制備的中藥液原液（200 mg/mL）稀釋104倍至0.02 mg/mL仍能對H9N2 AIV感染的雞胚提供100%的保護，稀釋105倍到0.002 mg/mL仍對H9N2 AIV在MDCK細胞上的復制具有良好的預防和治療效果，且預防效果優(yōu)于治療效果。結果證實本研究制備的中獸藥復方具有良好的抗H9N2 AIV效果。另外本復方根據家禽生理特點，加強了化痰、平喘、控制炎性滲出、潤肺瀉肺和健脾補腎利濕藥物，在直接抗病毒的基礎上進一步提升機體免疫力，若應用到臨床應該可以收到更加顯著的效果，在后續(xù)的研究中我們將通過動物實驗進一步證實，并深入探討該中獸藥復方的作用機理。

綜上所述，本研究制備的中獸藥復方提取液對雞胚基本無毒副作用，并能明顯抑制H9N2 AIV在細胞和雞胚中的增殖，為臨床防治家禽呼吸系統(tǒng)疾病提供理想的抗病毒藥物。

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