李辰龍王洪斌孫 心于洪濤

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司,黑龍江哈爾濱 150040)

鴨病毒性肝炎活疫苗（CH60株）規(guī)?；a(chǎn)工藝改進(jìn)試驗(yàn)

李辰龍1，2王洪斌1孫 心2于洪濤2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司,黑龍江哈爾濱 150040)

在鴨病毒性肝炎活疫苗(CH60株)生產(chǎn)時,用10日齡和11日齡進(jìn)行病毒增值,同時把病毒稀釋倍數(shù)由100倍改為5000倍,將雞胚死亡高峰期、最終死亡率、單胚平均收獲單產(chǎn)、病毒含量ELD50進(jìn)行對比分析,結(jié)果表明將病毒進(jìn)行100倍稀釋后,用11日齡雞胚增值鴨病毒性肝炎弱毒(CH60株)與10日齡雞胚相比死亡高峰期時間、最終死亡率、病毒含量ELD50、單胚平均收獲單產(chǎn)等基本相同;將病毒進(jìn)行5000倍稀釋后,用11日齡雞胚增值鴨病毒性肝炎弱毒(CH60株)與10日齡雞胚相比死亡高峰期時間推遲12～24h,最終死亡率基本相同、單胚平均收獲單產(chǎn)可提高30%左右、病毒含量ELD50略有上升;采用5000倍稀釋病毒,接種11日齡雞胚的生產(chǎn)工藝可以提高收獲單產(chǎn),降低生產(chǎn)成本,提高產(chǎn)品效價。

鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒(CH60株);稀釋倍數(shù);接種日齡

鴨肝炎病毒包含小RNA病毒科、星狀病毒科和嗜肝病毒科3個病毒科。嗜肝病毒科的鴨肝炎病毒引起鴨乙型肝炎，其對鴨沒有顯著的致病性；星狀病毒科的鴨肝炎病毒引起Ⅱ型鴨肝炎；小RNA病毒科的鴨肝炎病毒引起Ⅰ型和Ⅱ型鴨肝炎，Ⅱ型鴨肝炎病毒的致病力不如Ⅰ型鴨肝炎病毒，對雛鴨的治病率一般不超過30%?，F(xiàn)在流行的鴨肝炎主要是指Ⅰ型鴨肝炎，主要發(fā)生于雛鴨，臨床表現(xiàn)為發(fā)病急、死亡快，是一種具有急性、高度接觸性和致死性的傳染性疾病，死亡率可高達(dá)100%，給養(yǎng)鴨業(yè)造成很大危害。

哈藥疫苗有限公司用鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒（CH60株）生產(chǎn)的鴨肝炎活疫苗，對預(yù)防Ⅰ型鴨肝炎有較好的效果，但在實(shí)際生產(chǎn)中用10日齡雞胚生產(chǎn)時，存在雞胚死亡時間早，不易收獲，單產(chǎn)低的情況。為解決這一實(shí)際情況，我們從種毒稀釋倍數(shù)和接種的雞胚日齡上，做了很多相關(guān)試驗(yàn)，取得了一定的效果。

1 材料

（1）毒種

鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒種（CH60株）由哈藥疫苗有限公司質(zhì)量管理部提供，符合毒種標(biāo)準(zhǔn)，-70℃冰柜保存。

（2）SPF種蛋由哈藥疫苗有限公司SPF雞場提供，符合SPF種蛋標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2 方法

2.1 分組

將孵化到10日齡和11日齡的SPF的雞胚，各取400枚，再將10日齡的SPF雞胚400枚，分為A組和B組，每組分別為200枚；將11日齡的SPF雞胚400枚，同樣分為A組和B組，每組分別為200枚；

2.2 接種

分別將毒種進(jìn)行100倍和5000倍稀釋，然后將100倍稀釋的種毒分別接種10日齡和11日齡雞胚的A組。將5000倍稀釋的種毒分別接種10日齡和11日齡雞胚的B組。每胚均為0.2ml/胚。

2.3 病毒增殖

接種后用蠟封孔，濕度60%，溫度37℃靜置培養(yǎng)。24h照胚棄掉早死的雞胚，然后每隔6h照胚一次，將死亡的雞胚2～8℃保存，到96h將雞胚全部取出2～8℃保存，活胚棄掉不要，記錄雞胚各時間段死亡情況。將2～8℃保存的雞胚24h內(nèi)及時收獲，然后一起稱重、研磨混勻，留樣測ELD50使用。計算雞胚死亡高峰期、計算最終死亡率、單胚平均收獲單產(chǎn)。

2.4 病毒含量測定

將各組測病毒含量ELD50的留樣分別用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-84個稀釋度，每個稀釋度各尿囊腔接種發(fā)育良好的10日齡SPF雞胚5枚，0.2ml/胚，然后放在濕度60%，溫度37℃，靜置培養(yǎng)，24h死胚棄掉，觀察96h，記錄死亡情況，計算ELD50結(jié)果?！?〕

2.5 相同試驗(yàn)重復(fù)3次，進(jìn)行對比

3 結(jié)果與分析

3.1 雞胚接種后死亡高峰期和最終死亡率

鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒（CH60株），100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚與5000倍稀釋后接種10日齡的雞胚比較，死亡高峰期時間、最終死亡率基本相同。但5000倍稀釋后接種的11日齡雞胚，死亡高峰期時間推遲12～24h、最終死亡率與其他3組基本相同。見表1、圖1

圖1 最終死亡率對比

病毒100倍稀釋與5000倍稀釋相比，單位體積內(nèi)病毒數(shù)量多了50倍，但病毒對雞胚的致死能力較強(qiáng)，所以10日齡和11日齡雞胚最終死亡率基本相同，沒有明顯差異；

而5000倍稀釋后，單位體積內(nèi)病毒數(shù)量變成了1/50，病毒需要繁殖到一定數(shù)量，才能致死雞胚。11日齡雞胚對病毒的抵抗力較10日齡雞胚強(qiáng)，所以11日齡雞胚死亡時間推遲12～24h。

100倍稀釋接種11日齡雞胚與5000倍稀釋接種10日齡雞胚相比，雖然稀釋倍數(shù)相差50倍，但10日齡雞胚抵抗力沒有11日齡雞胚強(qiáng)，所以死亡高峰時間和最終死亡率基本相同。

3.2 雞胚接種后病毒含量和單胚平均收獲單產(chǎn)

鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒（CH60株），100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚與5000倍稀釋后接種10日齡雞胚比較，病毒含量ELD50基本相同。5000倍稀釋后接種11日齡雞胚，病毒含量ELD50略有提升。

100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚單胚平均收獲單產(chǎn)基本相同；5000倍稀釋后接種11日齡雞胚，單胚平均收獲單產(chǎn)提高近30%。見圖2、見圖3

表1 雞胚接種后觀察結(jié)果、死亡高峰期、最終死亡率對比

圖2 平均收獲單產(chǎn)對比

圖3 病毒含量測定結(jié)果對比

100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚與5000倍稀釋后接種10日齡的雞胚比較，死亡高峰期時間、最終死亡率基本相同。病毒繁殖的時間基本相同，所以病毒含量ELD50基本相同。而5000倍稀釋后，單位體積內(nèi)病毒數(shù)量變成了1/50，病毒需要繁殖到一定數(shù)量，才能致死雞胚，病毒繁殖時間延長，但10日齡雞胚較弱死亡早，所以接種11日齡雞胚病毒含量略有提升。

100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚與5000倍稀釋后接種10日齡的雞胚比較，死亡高峰期時間、最終死亡率基本相同。所以平均收獲單產(chǎn)基本相同。

5000倍稀釋接種11日齡，因雞胚對病毒的抵抗力較10日齡雞胚較強(qiáng)，死亡時間推遲12～24h，所以雞胚發(fā)育較大，平均收獲單產(chǎn)提高30%。見圖3

100倍稀釋接種11日齡雞胚與5000倍稀釋接種10日齡雞胚相比，死亡高峰時間和最終死亡率基本相同。所以病毒含量和平均收獲單產(chǎn)沒有明顯差異。但平均收獲單產(chǎn)，較100稀釋倍接種10日齡雞胚略高。

4 討論

（1）病毒100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚，5000倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚，4個組相比，因?yàn)椴《颈旧韺﹄u胚的致死能力較強(qiáng)，所以最終死亡率基本相同，但11日齡雞胚對病毒的抵抗力稍強(qiáng)，所以死亡高峰時間推遲12～24h，雞胚發(fā)育時間相對長，病毒繁殖時間要相應(yīng)長，所以收獲單產(chǎn)提高30%左右，病毒含量略有提升。

（2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雞胚的死亡高峰期，與雞胚對病毒的抵抗力、接種的病毒數(shù)量有直接的關(guān)系。10日齡雞胚與11日齡雞胚相比抵抗力差，所以減少病毒接種數(shù)量，其死亡的高峰期也沒有推遲。

（3）10日齡雞胚無論是100倍接種，還是5000倍接種，死亡時間都很早，雞胚發(fā)育小，再加上病毒對雞胚的作用，胚體較嫩，收獲時容易斷，也影響單產(chǎn)。11日齡雞胚本身多發(fā)育24h，胚體較有韌性，5000倍接種后又增加了一定的發(fā)育時間，所以收獲起來更容易，所以平均收獲單產(chǎn)增加較高。

（4）據(jù)有關(guān)資料介紹鴨肝炎病毒也可以在鴨胚成纖維細(xì)胞、鴨胚肝細(xì)胞上生長繁殖，今后在規(guī)?；a(chǎn)上可以尋找適合的細(xì)胞來培養(yǎng)鴨肝炎病毒來替代雞胚培養(yǎng)，即可以降低生產(chǎn)成本，又可以減少生物安全方面的風(fēng)險。

[1] 王勇，李廣興，劉思國.鴨病毒性肝炎的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2007，（3）：7-9.

[2] 殷震，劉景華.動物病毒學(xué)（第二版）[M].北京：科學(xué)出版社，1997：510-511.

[3] 王明俊.獸醫(yī)生物制品學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：297-309.

李辰龍，男，獸醫(yī)師，長期從事獸用生物制品質(zhì)量檢驗(yàn)與生產(chǎn)工作。

王洪斌，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：獸醫(yī)科學(xué)專業(yè)研究。