楊慈清李小英　王聰睿張必超　李　晗　林俊堂(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院，新鄉(xiāng)453003)

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N-cadherin通過β-catenin調(diào)控雞胚脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射①

楊慈清②李小英王聰睿②張必超李晗林俊堂③
(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院，新鄉(xiāng)453003)

［摘要］目的:闡明雞胚發(fā)育過程中神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在脊髓連合纖維發(fā)育中的作用。方法:在雞胚發(fā)育第3天(stage22)，將N-cadherin和β-catenin干擾載體通過活體電轉(zhuǎn)基因技術導入脊髓，電轉(zhuǎn)后繼續(xù)培養(yǎng)3 d(stage29)，取材、固定、包埋和切片。分為N-cadherin干擾組、β-catenin干擾組，β-catenin和N-cadherin共同干擾組以及轉(zhuǎn)染pGU6-GFP-neo表達質(zhì)粒對照組;采用熒光免疫組織化學法檢測N-cadherin和β-catenin蛋白表達變化;根據(jù)GFP表達結果，觀察脊髓連合纖維的投射情況。結果:在雞胚發(fā)育過程中，在脊髓抑制N-cadherin的表達會降低β-catenin的表達;在N-cadherin抑制表達72 h后觀察到脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射產(chǎn)生被抑制;抑制β-catenin表達出現(xiàn)類似向?qū)?cè)投射障礙; N-cadherin和β-catenin同時被干擾時，連合纖維投射的抑制效果相似。結論: N-cadherin參與調(diào)控脊髓連合纖維的發(fā)育過程，其部分作用機制可能是通過下調(diào)β-catenin的表達實現(xiàn)的。

［關鍵詞］雞胚;神經(jīng)鈣黏蛋白;β-連環(huán)蛋白;神經(jīng)纖維

①本文受2013年河南省教育廳科學技術研究重點項目(13A320866)、新鄉(xiāng)醫(yī)學院科研培育基金(2013QN125)、新鄉(xiāng)醫(yī)學院科研培育基金(2013QN115)和新鄉(xiāng)醫(yī)學院博士啟動基金(505090)資助。

②河南省醫(yī)用組織再生重點實驗室，新鄉(xiāng)453003。

N-cadherin regulates projection of spinal commissural axons via β-catenin during chicken embryonic development

YANG Ci-Qing，LI Xiao-Ying，WANG Cong-Rui，ZHANG Bi-Chao，LI Han，LIN Jun-Tang.College of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China

［Abstract］Objective: To explore the role of N-cadherin and β-catenin in the formation of spinal commissural axon projection during chicken embryonic development.Methods: Fertilized eggs were cultured for three days(stage22)，N-cadherin or β-catenin interference plasmid was injected into the neural tube and in vivo electroporation was performed.Three days after the electroporation，embryos were collected，fixed with 4% PFA，embeded with OCT，and cut into frozen sections.Four groups (knockdown of N-cadherin or βcatenin or both of them，and control) were included in this study.Immunohistochemistry method was used to analyze the protein expression result of N-cadherin or β-catenin.The changes of spinal commissural projections were observed with GFP fluorescence.Results: During chicken embryonic development，knockdown of N-cadherin inhibited the expression of β-catenin in the spinal cord.The commissural nerve fibers projecting to the contralateral side of the spinal cord was impaired after knockdown of N-cadherin or β-catenin; this phenotype was similar after knocking down both of them.Conclusion: N-cadherin is implicated in the formation of spinal commissural projection in the developing spinal cord，possibly via β-catenin.

［Key words］Chicken embryonic; Neural cadherin;β-catenin; Nerve fibers

神經(jīng)系統(tǒng)具有左右對稱的結構特征，連合纖維是系統(tǒng)兩側(cè)信息交換的主要形式。在雞胚發(fā)育過程中，脊髓兩側(cè)的神經(jīng)纖維也存在交互向?qū)?cè)的投射，即脊髓的連合纖維［1］。楊琳等［2］曾以成年大鼠作為動物模型，應用辣根過氧化物酶逆行標記脊髓連合纖維，證明了在哺乳動物脊髓中也存在神經(jīng)纖維的投射。在胚胎發(fā)育過程中，連合纖維神經(jīng)元產(chǎn)生于神經(jīng)管的背側(cè)，在向腹側(cè)遷移過程中發(fā)出連合纖維，經(jīng)過底板投射到對側(cè)脊髓。這一過程受到多種神經(jīng)導向因子的調(diào)控，如表達在脊索和底板的Netrin誘導表達其受體DCC的連合纖維的軸突朝向腹側(cè)中線的生長過程［3，4］。N-cadherin是一種重要的黏附分子，在雞胚發(fā)育過程中N-cadherin在脊髓中的表達具有典型的時空性變化，尤其在連合纖維的發(fā)育階段［5］。連環(huán)蛋白β-catenin是經(jīng)典Wnt通路的重要和關鍵分子，作為轉(zhuǎn)錄輔助因子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。如它參與神經(jīng)系統(tǒng)的模式發(fā)生、神經(jīng)前體細胞增殖分化以及神經(jīng)元突起形成等方面。研究顯示胞內(nèi)β-catenin濃度的較高水平是維持神經(jīng)干細胞增殖狀態(tài)的必要條件，在剔除β-catenin的基因突變鼠，大腦和脊髓的神經(jīng)組織體積下降，神經(jīng)前體細胞數(shù)量顯著減少［6-8］。對海馬等神經(jīng)元的研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)游離β-catenin水平還影響著神經(jīng)元突起的形態(tài)發(fā)生，高水平的β-catenin能促進神經(jīng)元樹突的分支［9］。本實驗借助雞胚活體電轉(zhuǎn)基因技術，下調(diào)N-cadherin和β-catenin的表達，分析其對脊髓神經(jīng)纖維投射的影響，為了解它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用提供證據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器pCAGGS-GFP(綠色熒光蛋白)質(zhì)粒由本實驗室保存; N-cadherin干擾載體(百奇生物科技有限公司合成)，干擾靶序列: GCAAATGAAGGTGAAGCTAAC，所用載體pGPU6-GFP-Neo; β-catenin干擾載體(百奇生物科技有限公司合成)，干擾靶序列: GCTTTAGGACTCCACCTTACA，所用載體pGPU6-GFP-Neo;一抗兔抗雞N-cadherin(Redies實驗室饋贈) ;小鼠抗β-catenin單克隆抗體(中杉金橋生物技術有限公司) ;二抗山羊抗兔Cy3標記(中杉金橋生物技術有限公司) ;山羊抗小鼠Cy3標記(中杉金橋生物技術有限公司) ; Dapi(Roche公司) ;質(zhì)粒DNA大量提取試劑盒(北京康為世紀生物技術有限公司) ;受精雞蛋(本地種雞場) ; CUY-21型多功能活體電轉(zhuǎn)儀(日本NEPAGene公司) ; M205FA型倒置體視熒光顯微鏡(德國Leica公司) ; Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本NIKON) ; CM1850冰凍切片機(德國Leica)。

1.2方法

1.2.1雞胚培養(yǎng)從種雞廠購買的新鮮受精雞蛋，當天帶回實驗室，用溫水洗凈、擦干，水平放入孵化箱。在溫度37.8℃，濕度65%，轉(zhuǎn)蛋間隔2 h的條件下孵育到第3天(stage 22)，用10 ml注射器針頭吸取3～4 ml蛋清，用眼科手術剪刀從上方針孔處將上面蛋殼剪開2～4 cm圓形開口，暴露卵黃和胚盤，進行活體電轉(zhuǎn)基因操作。轉(zhuǎn)染后醫(yī)用膠布密封開口繼續(xù)培養(yǎng)到特定時間進行觀察和取材。

1.2.2雞胚轉(zhuǎn)染2 μg/μl的pGU6-GFP-neo-N-cadherin-shRNA質(zhì)粒和0.5 μg/μl的pCAGGS-GFP質(zhì)?；旌弦?，2 μg/μl的pGU6-GFP-neo-β-cateninshRNA質(zhì)粒與0.5 μg/μl pCAGGS-GFP質(zhì)?；旌弦? 2 μg/μl的pGU6-GFP-neo-N-cadherin-shRNA質(zhì)

粒和2 μg/μl的pGU6-GFP-neo-β-catenin-shRNA質(zhì)粒與0.5 μg/μl pCAGGS-GFP質(zhì)?；旌弦?，以及2 μg/μl的pGU6-GFP-neo和0.5 μg/μl pCAGGS-GFP的對照質(zhì)粒，分別各取0.5～1 μl混合液用顯微注射毛細玻璃針在體視顯微鏡下注射到神經(jīng)管的中央管內(nèi);電極放在已注射質(zhì)粒的神經(jīng)管兩側(cè)，陽性電極在擬轉(zhuǎn)基因一側(cè)。電轉(zhuǎn)電壓18 V，電脈沖長度60 ms，間隔90 ms，電脈沖6次。電擊后用醫(yī)用膠布密封開口，整個過程在無菌操作工作臺內(nèi)完成;放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 d，依次在倒置體視熒光顯微鏡下觀察結果，電轉(zhuǎn)部位呈現(xiàn)綠色熒光者視為陽性。

1.2.3取材與切片每組至少收集3個胚胎。取出整個胚胎，切下脊髓區(qū)域，置于4%多聚甲醛(PFA)中過夜;取出組織，吸干液體，轉(zhuǎn)移到18%蔗糖溶液過夜;待沉淀到管底部時取出組織，用OCT包埋，置于液氮中冷凍后放－80℃冰箱儲存?zhèn)溆?。切片時從－80℃冰箱取出已包埋的組織，在冷凍切片機上連續(xù)切片，切片分為10套;切片后置烤片機37℃烤片30 min以上，置－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4熒光免疫組織化學從－80℃低溫冰箱中取出的冷凍切片置40℃干燥20 min，4%PFA中4℃固定15 min，用1×TBS清洗3次，每次5 min，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5 min。每張載玻片上加1 ml免疫組化封閉液孵育1 h。去除封閉液后每張載玻片加300 μl用封閉液稀釋的合適濃度的一抗:兔抗雞N-cadherin(1∶500)或鼠抗βcatenin(1∶100) 4℃孵育過夜。經(jīng)l×TBS清洗3次，每次5 min，每張片加300 μl用封閉液稀釋的用Cy3標記的針對一抗的二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育4 h。經(jīng)DAPI襯染后封片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。用Photoshop CS3軟件處理圖片，將3顏色同位拼合在一起，從而分析不同蛋白質(zhì)的表達定位;熒光強度平均光密度和面積采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行分析;數(shù)據(jù)處理采用SPSS Statistics17.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2　結果

2.1雞胚發(fā)育過程脊髓中敲減N-cadherin或βcatenin的表達在實驗中，采用shRNA干擾質(zhì)粒，借助雞胚活體原位電轉(zhuǎn)基因技術，在雞胚脊髓中對N-Cadherin和β-catenin分別進行干擾。在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的一側(cè)(圖1B)，N-cadherin的表達相對于對側(cè)降低(圖1C)，說明N-cadherin的shRNA干擾載體能夠抑制N-cadherin在雞胚脊髓中的表達。在轉(zhuǎn)染β-catenin干擾質(zhì)粒的脊髓切片中，同樣可以觀察到電轉(zhuǎn)側(cè)(圖1N)的β-catenin表達也受到抑制(圖1O)。在N-cadherin和β-catenin干擾質(zhì)粒共同干擾組中，電轉(zhuǎn)側(cè)的N-cadherin(圖1S)和β-catenin(圖1W)的表達同時發(fā)生下降。在對照組中，N-cadherin(圖1A')或β-catenin(圖1E')在電轉(zhuǎn)側(cè)的表達與對側(cè)沒有差別。為進一步驗證其干擾效果，對N-cadherin和β-catenin熒光免疫組化結果借助圖像分析軟件進行分析，在分析過程中為了結果更具有可比性，充分利用雞胚脊髓的定時定位轉(zhuǎn)染優(yōu)勢，將脊髓橫切片從脊髓中央分為轉(zhuǎn)染測和對側(cè)未轉(zhuǎn)染側(cè)，在同一個采集視野范圍內(nèi)，統(tǒng)計平均光密度值，避免了由于組間拍照曝光時間長度的差異。根據(jù)統(tǒng)計結果從圖中(圖2)可以看出，轉(zhuǎn)染N-cadherin的shRNA干擾載體組中，轉(zhuǎn)染側(cè)N-cadherin和βcatenin表達的平均光密度值極顯著(P＜0.01)地低于對側(cè)。在轉(zhuǎn)染β-catenin干擾載體組中，轉(zhuǎn)染側(cè)N-cadherin的平均光密度與對側(cè)沒有太大差別，而βcatenin是低于對側(cè)的;在混合轉(zhuǎn)染組中轉(zhuǎn)染側(cè)N-cadherin和β-catenin都有降低，但差異不顯著;對照組中轉(zhuǎn)染側(cè)和對側(cè)N-cadherin和β-catenin不存在明顯的差別，統(tǒng)計結果與圖片中觀察到的結果一致，從該統(tǒng)計結果圖中能更直觀地看出其干擾的效果。

Note: The first column is nuclei staining with DAPI; the second column is the results of the report gene GFP expression; the third column C，K，S，A' is the results of N-cadherin (red) expression，and G，O，W，E' is the results of β-catenin (red) expression; the fourth column is the merge result.Scale bar is 200 μm in F' for all panels.

Note: * .show significant differences(P＜0.001) .

2.2下調(diào)N-cadherin或β-catenin的表達影響脊髓連合纖維的發(fā)育在抑制N-cadherin表達后，GFP標記的神經(jīng)纖維向?qū)?cè)的投射明顯減少(圖1B、F)。在下調(diào)β-catenin表達的脊髓中，GFP標記的神經(jīng)纖維向?qū)?cè)的投射也明顯減少(圖1J、N)。在同時下調(diào)N-cadherin和β-catenin的情況下，GFP標記的神經(jīng)纖維向?qū)?cè)脊髓腹側(cè)白質(zhì)內(nèi)也出現(xiàn)顯著降低，但并沒有顯示出比前兩情形更嚴重(圖1R、V)。在對照組中，GFP標記的神經(jīng)纖維在對側(cè)脊髓白質(zhì)內(nèi)大量分布(圖1Z、D')。為了更為直觀地對比連合纖維被抑制的結果，借助圖像分析軟件對脊髓橫切片GFP標記的細胞進行了分析，從脊髓中央分隔，統(tǒng)計被轉(zhuǎn)染側(cè)GFP表達面積，然后統(tǒng)計對側(cè)投射連合纖維GFP表達面積，計算投射連合纖維GFP表達面積與被轉(zhuǎn)染側(cè)GFP表達面積的比值，投射纖維越多比值越大，根據(jù)統(tǒng)計結果繪制柱形圖，從圖中(圖3)可以看到，與對照組相比，轉(zhuǎn)染組中都極顯著(P＜0.01)低于對照組，而轉(zhuǎn)染組間差異不顯著，統(tǒng)計結果與圖片中觀察到的現(xiàn)象統(tǒng)一。以上結果充分說明在抑制N-cadherin或β-catenin表達會影響連合纖維向脊髓對側(cè)的投射。

2.3 N-cadherin抑制表達對β-catenin表達的影響及其對神經(jīng)纖維投射影響作用的探討在抑制N-cadherin表達條件下，對β-catenin的表達進行了染色。從結果可以看到，在N-cadherin抑制表達的一側(cè)脊髓，β-catenin的表達也明顯下降(圖1G)。相反，抑制β-catenin表達后N-cadherin的表達并沒有明顯的變化(圖1K)，說明N-cadherin調(diào)控β-catenin的表達，而β-catenin并不調(diào)控N-cadherin的表達。因此，下調(diào)N-cadherin抑制脊髓連合纖維的投射作用中很可能是通過下調(diào)β-catenin的表達實現(xiàn)的。

圖3　不同組GFP標記脊髓橫切片對側(cè)投射纖維與轉(zhuǎn)染側(cè)GFP表達面積百分比Fig．3 Percentage of GFP expression in spinal cord slices from different groups of GFP labeled spinal cord slices

3　討論

在細胞內(nèi)β-catenin有兩個定位池:一個位于細胞膜，一個在細胞漿。β-catenin在細胞中有雙重作用:一是通過與細胞膜上cadherin相互作用，參與細胞間黏附。當β-catenin表達上調(diào)時，增強細胞間黏附作用，使細胞不容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。反之，βcatenin表達下調(diào)時，細胞間黏附作用被破壞，細胞更容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。另一作用是作為經(jīng)典Wnt信號通路中最重要的信息分子，調(diào)控細胞生長、分化和凋亡。Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路在生物進化中極為保守，從低等生物果蠅至高等哺乳動物，其成員都具有高度的同源性，Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路的活化由細胞質(zhì)中β-catenin蛋白水平?jīng)Q定［10］。有研究表明β-catenin在細胞內(nèi)的表達與N-cadherin呈正相關［11］。在我們的實驗中表明細胞內(nèi)βcatenin的表達受到N-cadherin的調(diào)控，但是N-cadherin的表達并不受β-catenin的調(diào)控，該研究結果與已報道的結果保持一致［11］。在前期實驗中，課題組研究表明N-cadherin可能影響位于膜上的β-catenin，N-cadherin表達抑制后會導致膜上β-catenin向細胞核聚集［12］。而關于β-catenin在Wnt/β-catenin信號通路的研究在腫瘤中的報道比較多［13，14］，在神經(jīng)纖維發(fā)育中作用的研究并不多。

在我們的實驗中，通過活體原位電轉(zhuǎn)基因技術和shRNA干擾技術結合，實現(xiàn)了在活體內(nèi)N-cadherin或β-catenin的抑制表達，觀察到在N-cadherin或β-catenin抑制表達的條件下都會影響到雞胚發(fā)育過程脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射。關于N-cadherin在神經(jīng)元以及神經(jīng)突起形成方面的研究早有報道［15］，但其機制并不清楚。在本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，在抑制N-cadherin表達時β-catenin的表達下調(diào)，而在抑制β-catenin表達的條件下N-cadherin的表達并沒有變化，說明N-cadherin的表達正向調(diào)控β-catenin的表達。此外，抑制N-cadherin還是βcatenin的表達都會對脊髓連合纖維向?qū)?cè)的投射產(chǎn)生明顯的影響，但同時抑制兩者表達的表型與單獨抑制時類似。因此推測抑制N-cadherin表達影響脊髓連合纖維發(fā)育的作用很可能是通過β-catenin實現(xiàn)的。考慮到N-cadherin和β-catenin組成的復合體在細胞黏附中發(fā)揮重要作用以及三種抑制表達的表型的相似性，N-cadherin和β-catenin很可能通過該方式參與脊髓連合纖維的發(fā)育過程。

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［收稿2015-04-17修回2015-07-07］

(編輯張曉舟)

doi:10．3969/j．issn．1000-484X．2015．10．013

作者簡介:楊慈清(1979年－)，男，博士，副教授，主要從事發(fā)育神經(jīng)生物學研究，E-mail: yangciqing@ 126．com。

通訊作者③，E-mail: developmentlab@ 126．com。

文章編號1000-484X(2015) 10-1357-05

文獻標志碼A

中圖分類號Q954.48