楊超逸

（內(nèi)蒙古大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

造血干細(xì)胞是一類能夠自我更新并具有分化成所有造血譜系細(xì)胞潛能的成體干細(xì)胞。造血干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)通過(guò)自我更新可以維持機(jī)體內(nèi)自身數(shù)量穩(wěn)定，成熟分化則支持機(jī)體的終身造血。上述干性功能的維持受特殊造血微環(huán)境的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。除此之外造血干細(xì)胞具有移植在體內(nèi)長(zhǎng)期重建各系造血和免疫功能。而造血干細(xì)胞的主要來(lái)源分為骨髓血、外周血和臍帶血、胎盤。造血干細(xì)胞移植是各種血液腫瘤、再生障礙性貧血癥、重度地中海型貧血癥以及一些先天性免疫缺乏癥或代謝性疾病的根本治療手段。HSCT是將自體或者異體供者的HSCs 移植入受者體內(nèi)以進(jìn)行長(zhǎng)期重建各系造血功能和免疫系統(tǒng)。HSCT 主要包括骨髓移植、外周血干細(xì)胞移植、臍血干細(xì)胞移植。其中臍帶血是上述三種方法中造血干細(xì)胞含量最為豐富的。盡管如此，一份臍帶血存儲(chǔ)的有核細(xì)胞也僅為3.0×108 左右，據(jù)了解，對(duì)應(yīng)1公斤體重的人需要使用2.0×107 的臍帶血有核細(xì)胞。因此一份臍帶血造血干細(xì)胞僅能夠支持體重在15 公斤左右的患者的移植治療?；颊唧w型較大會(huì)限制其使用，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致造血功能恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)，感染等并發(fā)癥發(fā)生率增高，患者移植相關(guān)死亡率增加。這也成為造血干細(xì)胞臨床應(yīng)用的一個(gè)主要瓶頸。為解決這一難題，科學(xué)家們致力于力求體外擴(kuò)增HSCs 數(shù)量，挽救更多的血液病患者。體外長(zhǎng)期擴(kuò)增培養(yǎng)臍帶血造血干細(xì)胞的研究日益受到重視，但是目前為止造血干細(xì)胞干性維持狀態(tài)下體外有效擴(kuò)增仍然是一個(gè)科學(xué)難題,在體外培養(yǎng)環(huán)境中很難獲得大量擴(kuò)增。近年來(lái)多項(xiàng)基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)因子混合物、與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)及加入小分子化合物激動(dòng)劑等具有人臍帶血造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增作用。

一、造血干細(xì)胞簡(jiǎn)述

造血干細(xì)胞是具有自我更新能力及分化為所有成熟造血細(xì)胞譜系潛能的多能成體干細(xì)胞。HSCs 位于造血系統(tǒng)級(jí)聯(lián)的頂端,在造血細(xì)胞譜系分化過(guò)程中,HSCs 首先失去自我更新能力,然后逐步丟失多能性,最終成為紅細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞、DC 細(xì)胞、B 細(xì)胞、T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞等有特定功能的成熟細(xì)胞類型。眾多信號(hào)通路及調(diào)控因子的遺傳學(xué)與表觀遺傳學(xué)網(wǎng)絡(luò)型調(diào)控在HSCs 的命運(yùn)決定、細(xì)胞死亡和存活、細(xì)胞分裂或靜息、細(xì)胞分化或自我更新、極性和遷移或定居等各種生物學(xué)行為中起重要作用。正常的生理?xiàng)l件下,機(jī)體內(nèi)HSCs 幾乎不分裂,主要處于靜息和休眠狀態(tài),只有一小部分HSCs 參與特定階段的活躍的造血生成。

二、小分子化合物在造血干細(xì)胞調(diào)控中的研究進(jìn)展

（一）小分子化合物的定義及其作用特點(diǎn)

小分子化合物指相對(duì)分子質(zhì)量小于10000 的化合物。在干細(xì)胞體外培養(yǎng)中，一些小分子化合物顯示了它們的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。首先，化合物的作用效果可以通過(guò)調(diào)節(jié)化合物的結(jié)構(gòu)、濃度來(lái)改變，其過(guò)程簡(jiǎn)單可控；其次，小分子化合物相較于細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子等性質(zhì)更為穩(wěn)定，化合物的前期處理以及給藥非常方便[5]。

（二）多糖類物質(zhì)對(duì)造血干細(xì)胞的調(diào)控

多糖類物質(zhì)可以在胰高血糖素的作用下影響HSCs 歸巢等活動(dòng)信號(hào)通路，如wnt／B.catenin 信號(hào)通路、P13K／AKT 信號(hào)通路和活mTOR 信號(hào)通路等的靶基因表達(dá)，進(jìn)而于維持HSC自我更新能力，提高HSC的歸巢能力，使HSC 顯著擴(kuò)增。

（三）GSK－3β 抑制劑BI0

其對(duì)HSC 細(xì)胞自我更新的影響可能是由于mTOR 信號(hào)通路的激活而受到抑制；c—MPL 小分子激動(dòng)劑NR.101、5-氮脫氧胞苷和組蛋白去乙?；敢种苿┒际峭ㄟ^(guò)減緩細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)HSC 的自我更新.

（四）TEPA 銅螯合劑

可以螯合細(xì)胞內(nèi)的銅離子，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)銅的水平，促進(jìn)HSC 自我更新；丙戊酸(vPA)和二乙基氨基苯甲醛(DEAB)可抑制HSC 分化；SIRTl可以促進(jìn)HSC 歸巢；前列腺素E2(PGE2)、Caspase 抑制劑及鈣蛋白酶抑制劑和血清素可以抑制HSC 凋亡。

（五）與氧化相關(guān)的小分子化合物對(duì)造血干細(xì)胞的調(diào)控

氧濃度是參與造血細(xì)胞發(fā)育微環(huán)境中的最主要的因素，低氧環(huán)境能夠降低活性氧的產(chǎn)生，使HSC 處于靜息狀態(tài)，HSC 表達(dá)，從而更好地維持了HSC 的遷移能力。有文獻(xiàn)報(bào)道，抗氧化劑可通過(guò)消除ROS 提高HSC 的功能，進(jìn)而改善HSC 移植存活率。目前，已發(fā)現(xiàn)的與HSC 調(diào)控相關(guān)的抗氧化小分子有N-乙酰-L-半胱氨酸NAC、DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑TSA/5azad、SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇、咖啡酸苯乙酯CAPE、丙戊酸VPA、尼克酰胺NAM、抗壞血酸磷脂酸鹽AA2P 等。

（六）UM171

UM171 是一種高效的HSCs 再生小分子激動(dòng)劑，可以增強(qiáng)人造血干/祖細(xì)胞的體外自我更新。UM171 對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的分裂速率沒(méi)有影響，但可以促進(jìn)細(xì)胞CD34+CD45RA-表型的維持，同時(shí)可以減少與紅系和巨核細(xì)胞分化有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)UM171 處理的細(xì)胞中，PROCR 基因顯著上調(diào)。同時(shí)，UM171 在人類多能干細(xì)胞衍生造血祖細(xì)胞方面也具有巨大潛力。

三、氧氣濃度對(duì)HSCs 體外擴(kuò)增的影響

在HSCs 體外培養(yǎng)過(guò)程中，為了能更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，氧濃度和小分子物質(zhì)是需要考慮到的重要影響因素。其中氧濃度是造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境和體內(nèi)造血微環(huán)境中的重要物化參數(shù)，常用的體外培養(yǎng)體系中的氧濃度一般可以高達(dá)21%，而體內(nèi)骨髓造血微環(huán)境中的氧濃度只有1－6%左右，兩者之間存在的這種顯著差別有可能對(duì)造血干細(xì)胞的擴(kuò)増、分化和生理功能產(chǎn)生重要影響。以往的研究已經(jīng)證實(shí)，在體外某些特定的因子、信號(hào)能有效地促進(jìn)HSCs 的擴(kuò)增和自我更新。研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)在培養(yǎng)基中添加小分子生物或者化學(xué)物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)HSCs 的功能。周立萍博士的研究團(tuán)隊(duì)選擇在CD34+細(xì)胞培養(yǎng)基中添加睪酮，腎上腺素，去甲腎上腺素這三種小分子物質(zhì)，并同時(shí)在常氧（20%）和低氧（1%）兩種氧濃度下培養(yǎng)，來(lái)觀察比較激素＋不同氧濃度這兩者相結(jié)合對(duì)HSCs 擴(kuò)增，細(xì)胞表型，基因表達(dá)的影響，以此來(lái)探討一種更好的HSCs 體外培養(yǎng)條件。

四、模擬HSCs 骨髓微環(huán)境

（一）造血干細(xì)胞微環(huán)境

造血干細(xì)胞微環(huán)境是位于血管周圍靠近骨小梁區(qū)，由骨髓間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞組成的維持和調(diào)節(jié)HSCs 生理功能的局部組織微環(huán)境。在Niche 中，Niche 細(xì)胞通過(guò)粘附分子和膜表面信號(hào)分子來(lái)與HSCs 直接或間接接觸進(jìn)而調(diào)控HSCs 的自我更新、增殖、分化等一系列生物學(xué)行為。[22]

（二）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，既往稱為骨髓基質(zhì)成纖維細(xì)胞,是一類起源于中胚層的成體干細(xì)胞,具有自我更新及多向分化潛能,可分化為多種間質(zhì)組織,如骨骼、軟骨、脂肪、骨髓造血組織等。骨髓BMSC 的遷移、定植、增殖與分化,需要從外界獲取信息。其分化方向取決于所在的微環(huán)境。這里的“微環(huán)境”不僅包括骨髓微環(huán)境,還包括局部間質(zhì)組織微環(huán)境。PMF患者骨髓微環(huán)境改變有:間質(zhì)細(xì)胞增多及發(fā)育異常的巨核細(xì)胞聚集、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白增加,血管生成增加,竇狀隙擴(kuò)張伴血管內(nèi)造血,骨硬化等。這種改變呈片狀分布,不同患者或同一患者不同部位骨髓改變有所不同。局部間質(zhì)組織微環(huán)境涉及多種因素骨髓基質(zhì)蛋白,細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間接觸,局部細(xì)胞、生長(zhǎng)因子濃度及受體表達(dá)情況等。AMM 患者骨髓成纖維細(xì)胞是否由骨髓BMSC 分化而來(lái)，尚未明確。但研究發(fā)現(xiàn)骨髓微環(huán)境、BMSC 及造血干細(xì)胞間存在極其微妙的關(guān)系,這可能與PMF 發(fā)病有關(guān)。

（三）BMCS+細(xì)胞因子模擬骨髓微環(huán)境

目前已經(jīng)確定的能在體外有效擴(kuò)增HSCs 的方法是在培養(yǎng)基中添加多種固定組合的造血細(xì)胞因子，能使HSCs 數(shù)量明顯增加，但擴(kuò)增所得HSCs往往失掉了長(zhǎng)期造血和重建免疫的功能。BMSC 是造血微環(huán)境中的重要組成部分，通過(guò)分泌多種造血細(xì)胞因子調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)，維持HSCs 的穩(wěn)定和功能，促進(jìn)其擴(kuò)增，增強(qiáng)其自我更新能力。

細(xì)胞因子組合和BMSC 的聯(lián)合應(yīng)用使造血細(xì)胞明顯擴(kuò)增，增殖迅速，且CD34+HSCs 的比例也明顯多于單獨(dú)使用細(xì)胞因子;同時(shí)，集落分析實(shí)驗(yàn)顯示，以這種方式擴(kuò)增的HSCs 在體外具有很強(qiáng)的集落形成能力，具有分化為各系造血細(xì)胞的能力。這表明MSCs 條件培養(yǎng)基和細(xì)胞因子組合相輔相承，條件培養(yǎng)基中豐富的細(xì)胞因子更進(jìn)一步加強(qiáng)了細(xì)胞因子組合的擴(kuò)增效應(yīng)，同時(shí)也一定程度上維持了HSCs 的穩(wěn)定和功能。

五、表觀遺傳學(xué)修飾劑

造血干細(xì)胞的自我更新和分化受到高度協(xié)調(diào)的表觀遺傳調(diào)控，其中組蛋白乙?；揎椏梢约せ罨虺聊虻霓D(zhuǎn)錄。組蛋白去乙?；敢种苿┛梢砸种圃煅杉?xì)胞中組蛋白去乙?；傅幕钚裕黾咏M蛋白乙?；?。多種HDACIs，如曲古他汀A、丙戊酸鈉等，被用于在體外無(wú)血清培養(yǎng)中與細(xì)胞因子組合聯(lián)合處理造血干細(xì)胞，尤其是臍血造血干細(xì)胞，促進(jìn)與干細(xì)胞自我更新相關(guān)的多能基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)造血干細(xì)胞擴(kuò)增，抑制分化，獲得數(shù)量更多的長(zhǎng)期重建細(xì)胞。

HDACIs 可以上調(diào)將早期HPCs 重編程為HSCs 的基因表達(dá)，這些與HSCs擴(kuò)增和功能維持有關(guān)的基因在HSCs 培養(yǎng)過(guò)程中被沉默，組蛋白乙?；艽龠M(jìn)這些基因表達(dá)。

羧酸類 HDACI 丙戊酸抑制類和a 類HDACs，能使CB-CD34+細(xì)胞表觀重編程，促進(jìn)CB-HSCs 擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)，含血清培養(yǎng)體系下VPA 處理HSCs 產(chǎn)生更多分化細(xì)胞，即大量祖細(xì)胞和短期重建細(xì)胞而非長(zhǎng)期重建細(xì)胞。

六、小結(jié)

綜上所述小分子化合物誘導(dǎo)干細(xì)胞分化，對(duì)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、成骨缺損等復(fù)雜的疾病有一定的臨床應(yīng)用，以及在HSC 和白血病干細(xì)胞的調(diào)控中有著重大的作用。小分子化合物對(duì)促進(jìn)HSC 的增殖以及調(diào)控白血病干細(xì)胞有著比較樂(lè)觀的應(yīng)用前景，相比于細(xì)胞因子來(lái)講,小分子化合物具有來(lái)源易得,結(jié)構(gòu)明了,作用靶點(diǎn)和機(jī)制容易深入研究的優(yōu)勢(shì)。發(fā)現(xiàn)更多安全可靠的、無(wú)毒副作用的，可體外擴(kuò)增HSC 或調(diào)控白血病干細(xì)胞的小分子化合物，對(duì)于解決人類的血液疾病及其他的一些疾病有著重大的意義。