張翡艷

摘要：血小板作為人體血液中的重要成份，在生理性止血中起著非常重要的作用。新鮮液體保存血小板，最長保存時間僅為5天，而冰凍保存血小板明顯延長了血小板保存期限，滿足了臨床急癥出血病人的需求。冰凍保存可能是維持生物細胞、組織活性的最理想的方法之一，也是許多研究人員目前致力研究的方向。然而，因為其保護劑選擇、保存及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等仍未能達成共識，使得冰凍血小板的使用未能形成國標(biāo)。本文對冰凍血小板國內(nèi)外研究進展做了綜述。

關(guān)鍵詞：冰凍血小板? 二甲基亞砜? 國家戰(zhàn)略儲備物資

【中圖分類號】R331.1???????????? 【文獻標(biāo)識碼】A???????????? 【文章編號】2107-2306（2021）11--03

在醫(yī)學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展的今天，隨著各種移植手術(shù)、高難度手術(shù)的增多，輸血治療在臨床上的作用日趨體現(xiàn)，成分輸血被廣泛運用，特別是強化療和骨髓移植的迅速開展，臨床上對血小板的需求急劇增加。新鮮液態(tài)血小板的常規(guī)保存條件為（22±2）℃、震蕩保存5天，其雖具有良好的功能，但因采集新鮮液態(tài)血小板耗時長、保存期短，易造成細菌污染，使用前需要提前預(yù)約，因此無法保障臨床急診患者的需求，特別是偏遠地區(qū)。深低溫冰凍保存是維持細胞、組織活性，保留新鮮血小板生理功能的較理想的方法之一，具有保存期長、可以大量儲備并且隨需隨取、供應(yīng)及時等優(yōu)點，尤其可用于特殊血型血小板和自體血小板儲備。本文對目前冰凍血小板保護劑的選擇、制備、應(yīng)用等方面的研究進展做綜述如下，以期為深低溫冰凍保存血小板的研究及應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 制備冰凍血小板保護劑的選擇

常用的保護劑可分為深低溫保護劑、冰凍干燥保護劑和低溫冷藏保護劑三大類。

深低溫保護劑又根據(jù)其能否通透細胞膜分為非通透性低溫保護劑和細胞膜通透性低溫保護劑。其中，常用的非通透性低溫保護劑有聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯二醇、乙烯乙二醇、白蛋白等。細胞膜通透性低溫保護劑如：二甲基亞砜、甘油等。多種深低溫冰凍保護劑聯(lián)合使用改善低溫凍存效果，滲透性和非滲透性保護劑的聯(lián)用可以改善低溫凍存效果已經(jīng)被證。通常認(rèn)為非滲透保護劑與滲透性冰凍保護劑聯(lián)用能降低冰凍保護劑的細胞毒性，但是Lawson等的研究表明：多種深低溫保護劑的聯(lián)用增加了其細胞毒性，聯(lián)用的深低溫保護劑在增加細胞毒性方面有協(xié)同作用，深低溫保護劑聯(lián)用不像以前想的那樣有益無害。

冰凍干燥保護劑常用的有海藻糖，低溫冷藏保護劑如尿嘧啶二磷酸半乳糖。有研究者將幾種保護劑混合使用，如二甲基亞砜與羥乙基淀粉聯(lián)用，還有二甲基亞砜與海藻糖聯(lián)用、二甲基亞砜與第二信使調(diào)節(jié)劑的混合物（TS）聯(lián)用等，多種低溫保護劑的聯(lián)合使用雖取得一些進展，但未達到理想狀態(tài)，達不到設(shè)計初衷，在保護劑的選擇搭配以及濃度選擇上有待進一步研究。盡管血小板低溫保護劑及使用方法有很多種，但是目前常用及研究最多的深低溫冰凍保護劑主要是單純選用5%-6%二甲基亞砜作為保護劑。

不論何種保護劑，其目的最主要的是在低溫處理過程中能夠保護細胞膜及細胞骨架的完整性，其次還應(yīng)該考慮細胞毒性、避免血小板激活等問題。大量研究表明二甲基亞砜有許多優(yōu)勢，如低細胞毒性、分子量小、強滲透性、易于穿透細胞、可使細胞內(nèi)冰點下降、提高包膜對水的通透性、減少細胞內(nèi)冰晶形成、可靜脈輸注等，同時還具有舒張血管、抗血小板聚集、防止微循環(huán)堵塞、消炎止痛、抑菌等優(yōu)點，使之成為研究首選。雖然5%-6%的二甲基亞砜冰凍保護劑無臨床輸注毒副作用，但其滲透性強、代謝物中有惡臭二甲基硫化物、致畸等原因，不能連續(xù)多次使用，因此在血小板冰凍保存中應(yīng)該盡量減少其用量。

2 冰凍血小板的制備

孫瑜等研究認(rèn)為75%DMSO的配制由DMSO原液與0.9%NaCl以3：1的體積比在無菌條件下配制，配好后置于-50℃冰箱保存，使用前取出，無需室溫平衡。在百級無菌室內(nèi)，以加藥件按1ml/min的速度緩慢將DMSO原液加入血小板懸液深部，邊加邊振（頻率60次/min），充分混勻，使終濃度為5%，振蕩8min后-80℃冰凍保存。

3 冰凍血小板的最佳保存溫度及保存時限

有研究表明，冰凍血小板儲存溫度越低，保存的時間就越長，效果越好。維持細胞生物活性、功能的最理想方法是程序降溫，即深低溫液氮（-179℃）冰凍保存，但由于該方法存在技術(shù)難度大，對設(shè)備要求高，需長期更換液氮，可能因偶然因素徹底損傷細胞等不利因素，不太適用于存量較大的血小板凍存。因此，深低溫冰箱（-80℃）凍存是維持細胞生物活性、保留新鮮血小板生理功能較理想的方法之一。深低溫凍存血小板的供給形式、數(shù)量保證和及時有效性等方面均優(yōu)于其他方法，且操作方法簡單容易，能極大地方便臨床使用。

血小板于冰凍保存期間儲存溫度波動，會導(dǎo)致冰晶機械作用使血小板損傷。冰凍血小板隨著貯存時間的延長，絮狀物析出的情況有顯著改變，原因可能是保存期間低溫冰箱門被多次開啟，導(dǎo)致溫度波動。貯存時間越長，開啟次數(shù)就越多，溫度波動就越大，血小板損傷的概率和程度就越大。劉景漢認(rèn)為，冰凍血小板在-80℃以下保存可達6-12個月，解凍后血小板聚集功能恢復(fù)良好，臨床使用效果理想。但在實際工作中，低溫冰箱門的反復(fù)開啟是不可避免的，因此建議保存期在6個月較適宜。

冰凍血小板復(fù)融溫度和時間也有明確規(guī)定，黃彥等認(rèn)為，血小板復(fù)融溫度為37-40℃，快速復(fù)溫應(yīng)在兩三分鐘內(nèi)完成。在天氣寒冷的冬天或者周圍環(huán)境溫度較低時，融化時間應(yīng)適當(dāng)延長，但融化時間不宜超過5分鐘。

盡管冰凍血小板在制備、保存和融解等過程中，血小部分被破壞，數(shù)量有所減少，但仍具有相對完整的超微結(jié)構(gòu)和較高的回收率。冰凍血小板在復(fù)融后越早輸注止血效果越好，應(yīng)囑臨床立即用經(jīng)濾血器快速輸注，如需保存也最好置于22℃環(huán)境中，保存時間不宜過長，建議盡可能在解凍后2小時內(nèi)輸完。二甲基亞砜對細胞的毒性作用在室溫中比低溫時大，因此應(yīng)盡量縮短在室溫中的停放時間，以減少二甲基亞砜的毒性反應(yīng)。

4 冰凍血小板的功能檢查

判斷冰凍血小板的輸注效果主要通過檢測其體外功能和體內(nèi)功能來判斷，體外檢測方法多樣，比如，血小板的聚集功能、血塊收縮試驗、粘附功能、分泌功能、膜表面促凝血活性的功能等，體內(nèi)功能主要通過檢測其數(shù)量的變化、出血情況的改善、血小板回收率及輸血療效等。

有相關(guān)研究表明，冰凍血小板在貯存到取用的過程中，將會損失超過25%的血小板。因此，新鮮液態(tài)血小板在血小板計數(shù)提升方面有明顯的優(yōu)勢。但是，陳興智認(rèn)為血小板體外功能實驗不能正確反映冰凍血小板的體內(nèi)止血功能，尤其是對出血傾向的內(nèi)科患者或外科滲血的患者，血小板計數(shù)或CCI值并未明顯升高，但是患者出血點消失，病灶出血減少或明顯好轉(zhuǎn)也說明是有效的。

研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮血小板比較，冰凍保存血小板產(chǎn)生了與冰凍前顯著不同的新亞群。冰凍后血小板中的CD62p陰性和CD62p陽性的血小板結(jié)合因子V的能力都顯著提高，特別是占低溫保存血小板總數(shù)50%的GPIb減少亞群結(jié)合V因子的能力比新鮮液體血小板高出多達5倍以上，促凝血活性明顯增強，低溫保存血小板的止血效果強于新鮮液態(tài)保存3～4天的血小板^[25]。冰凍血小板膜表面黏附受體的結(jié)合能力明顯增強，促凝血活酶明顯提高，新的亞群的出現(xiàn)使得血小板對V因子的結(jié)合能力大大增強，CD62（ Pselectin）表達明顯增高，使即刻止血效果顯著。同時凝血酶激活的CD62p陰性亞群血小板在輸入受血者體內(nèi)，可在外周血正常存活，提高受血者外周血血小板水平。血小板通過低溫保存后產(chǎn)生了新亞群，新亞群膜表面功能分子的變化與其體內(nèi)存活率減少而即刻止血功能增強密切相關(guān)。冰凍血小板與新鮮血小板膜表面上亞群分子不同，部分冰凍血小板被激活，細胞膜表面血小板分子或受體發(fā)生改變或丟失，可能是冰凍血小板獲得即刻止血功能明顯增強特性的機理之一。

新鮮血小板由于血漿蛋白或其他抗原作用，輸注新鮮血小板容易發(fā)生顏面部嚴(yán)重水腫輸血反應(yīng)，也可以發(fā)生過敏性休克。輸注新鮮液態(tài)血小板發(fā)生過敏性蕁麻疹的病例，改輸冰凍血小板后解決了患者輸血不良反應(yīng)的同題，冰凍血小板輸注后類似反應(yīng)未見有報道，可能是抗原性較強的血漿蛋白等物質(zhì)冷凍后抗原性減弱是冰凍保存血小板不發(fā)生類似反應(yīng)的主要原因。

截止到目前，血小板的功能檢測在臨床上仍沒有一個“金標(biāo)準(zhǔn)”，因為冰凍保存的血小板雖然出現(xiàn)形態(tài)改變及功能受損，但其輸注到人體內(nèi)仍能產(chǎn)生止血作用。制定一個血小板質(zhì)量評價的最佳指標(biāo)對于正確評價血小板制品的輸注效果意義重大。

5 冰凍血小板的臨床應(yīng)用

血小板經(jīng)深低溫冰凍保存后，磷脂酰絲氨酸、CD62P等功能分子的表達、丟失和再分布，使其即刻止血效果功能明顯增強：產(chǎn)生了新的亞群，使其促凝血活性明顯提高，代謝基本停止，有害因子產(chǎn)生明顯降低，因而輸血反應(yīng)率降低。細胞膜表面黏附受體的結(jié)合能力明顯增強，使凝血活性明顯提高，大量的血小板因子被釋放出來，即刻止血效果顯著。

研究發(fā)現(xiàn)，冰凍單采血小板外科病例有效率高于新鮮單采血小板，這主要與外科多用于婦產(chǎn)科、骨科、創(chuàng)傷大出血及手術(shù)出血等病例的止血治療，冰凍單采血小板經(jīng)冰凍保存后細胞膜表面粘附受體的結(jié)合能力增強促凝血活性提高，且活化的血小板及其裂解產(chǎn)物同樣具有凝血、止血保護功能，即可止血效果顯著有關(guān)，同時，也進一步印證了Antonio等認(rèn)為冰凍血小板比新鮮血小板止血功能更有優(yōu)勢的觀點。但冰凍單采血小板在內(nèi)科病例的無效率高于外科病例（P<0.05），而新鮮單采血小板在這方面的差異卻不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），這與內(nèi)科多用于血液系統(tǒng)、腫瘤放化療疾病等病例的預(yù)防性治療，冰凍單采血小板復(fù)蘇后容易被激活，在體內(nèi)壽命縮短，而新鮮單采血小板提升外周血血小板計數(shù)比冷凍單采血小板顯著有關(guān)。該類內(nèi)科病例因反復(fù)多次輸注出現(xiàn)免疫性血小板輸注無效，應(yīng)盡量采用HLA配合的新鮮單采血小板輸注。

可見，冰凍血小板在臨床應(yīng)用中與新鮮血小板具有同等的有效性和安全性，可廣泛用于臨床，特別是在外科止血療效上具有獨特的優(yōu)勢。但對反復(fù)輸注或血小板輸注無效病例應(yīng)優(yōu)先選擇新鮮血小板，以降低血小板輸注無效和患者出血風(fēng)險，提高臨床療效，有效保護血液資源。

6 存在問題

目前，血小板的冰凍保存研究還未取得突破性進展，-80℃的冰凍保存雖然延長了保存時間，血小板內(nèi)的生物活性物質(zhì)也受到保護，但其應(yīng)用仍然受到很大地限制。如何降低低溫貯存損傷，提高血小板的輸注效果;怎樣降低保護劑的毒性，增加血小板輸注的安全性等等，這些問題一直存在，也是冰凍保存血小板研究的難點。冰凍保存后的血小板輸注到人體內(nèi)雖然存活時間較長，但與新鮮液態(tài)血小板仍有一定的差距，且二甲基亞砜的細胞毒性不能避免。如何能在保證血小板質(zhì)量的情況下降低二甲基亞砜的濃度，增加輸注的安全性，也是研究者們應(yīng)該克服的一道難題。

深低溫冰凍保存血小板從制備、保存、使用到質(zhì)量檢測等指標(biāo)方面，目前均沒有明確的國際或國家標(biāo)準(zhǔn)。因此，在實際應(yīng)用中無統(tǒng)一的做法，一定程度上阻礙了冰凍血小板的推廣使用。新頒布的《全血及成分血質(zhì)量要求》（GB18469-2012）血液制劑方面并未提及冰凍血小板。血小板深低溫保護劑二甲基亞砜具有滲透性強、代謝物二甲基硫化物有惡臭并有致畸等毒性作用，其在臨床上的應(yīng)用受到極大的限制。針對血小板深低溫保存時所用保護劑二甲基亞砜的代謝產(chǎn)物有副作用的爭議，中國國家食品藥品監(jiān)督管理局2007年指明二甲基亞砜可用于血小板、干細胞的低溫保存和不經(jīng)洗滌的臨床輸注。

7 展望

深低溫冰凍保存血小板是長期大量保存血小板的有效方法。冰凍血小板的出現(xiàn)在很大程度上彌補了新鮮液態(tài)血小板在臨床上供應(yīng)不足的缺點，為臨床提供了保障，也為很多患者贏得了時間，尤其是在骨髓干細胞移植、急危重癥患者搶救、惡性腫瘤大劑量化療等醫(yī)學(xué)新技術(shù)的應(yīng)用中發(fā)揮著重要的作用。同時，血小板具有非常重要的戰(zhàn)略性地位，大的自然災(zāi)害、戰(zhàn)爭，都離不開血小板的及時、足量輸注。因此，深低溫冰凍血小板應(yīng)作為國家重要的戰(zhàn)略儲配物資。

血液制品是一種具有生物活性的特殊藥品。既是藥品，必然具有副作用，即使有副作用，仍要用于臨床。比如輸血存在經(jīng)血傳播疾病的風(fēng)險依然要輸注;如緊急狀況下允許少量○型紅細胞的異型輸注。藥品如抗腫瘤的放化療藥，既殺死腫瘤細胞也殺死正常細胞，卻依然要推廣于臨床。所以，筆者認(rèn)為即使目前深低溫冰凍血小板保護劑的選擇等方面仍有不完善的地方，也應(yīng)該允許按一定的比例制備冰凍血小板，如控制在血小板使用總量的15%以下，以新鮮液態(tài)血小板的替補角色存在。因為沒有生命，就沒有一切，生命權(quán)應(yīng)該是排第一位的。因此，目前不應(yīng)一刀切，而應(yīng)允許少量的、限制性地使用5%-6%二甲基亞砜作為保護劑的深低溫冰凍血小板，一邊優(yōu)化深低溫冰凍保存血小板的制備方案。期待不久的將來，能有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)出臺，將深低溫冰凍保存血小板技術(shù)推廣于臨床，那將是一個里程碑式的改變。

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