陳和萍 韓鈞凌 俞力軍 邢 苑 張 宏

（中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二八醫(yī)院消化內科，?？?70206）

胃癌是最常見的人類胃腸惡性腫瘤之一，是導致全球癌癥相關死亡的第二大原因［1］。大多數胃癌患者被診斷為晚期，并伴有惡性增殖、廣泛浸潤和淋巴轉移，手術、放化療和靶向治療聯合應用后效果有限，死亡率較高［2-3］。近年來，長鏈非編碼RNA（lncRNA）調控微小RNA（miRNA）在腫瘤發(fā)生、轉移、耐藥進程中的復雜作用引起研究者的廣泛關注。LINC00680最初被鑒定為一種保護性生物標志物，是軟組織肉瘤的獨立預后指標［4］。在膠質瘤中LINC00680 高表達卻促進癌細胞的增殖、遷移和轉移，抑制細胞凋亡，發(fā)揮致癌作用［5］。序列分析發(fā)現，miR-431-5p 與LINC00680 之間存在相互作用。既往研究顯示，胰腺癌、結腸癌中miR-431-5p 表達降低，過表達miR-431-5p 對腫瘤進展具有抑制作用［6-7］。然而LINC00680 在胃癌進展中的作用，其機制是否與調控miR-431-5p 有關仍不清楚。本研究通過檢測胃癌細胞中LINC00680、miR-431-5p 表達水平，探討抑制LINC00680 或過表達miR-431-5p 對胃癌細胞增殖、上皮間充質轉化（epithelial mesen‐chymal transition，EMT）、遷移和侵襲的影響，分析LINC00680 和miR-431-5p 之間調控關系，以期為胃癌治療提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃黏膜上皮永生細胞系GES1、胃癌細胞系SNU-1、HS-746T 和AGS 購于中國科學院上海細胞庫；RPMI1640 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、胎牛血清購于武漢普諾賽生命科技公司；所有載體、序列片段由北京華大基因公司提供；逆轉錄試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購于Promega 公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購于大連 TaKaRa 公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）購于上海晶抗生物；Transwell小室和基質膠購于美國康寧公司；細胞周期素D1（CyclinD1）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、MMP9 兔多克隆抗體、羊抗鼠IgG 二抗購于美國Abcam 公司；上皮細胞鈣黏蛋白（E-Cadherin）、神經鈣黏素（N-Cad‐herin）、波形蛋白（Vimentin）鼠單克隆抗體、羊抗鼠IgG二抗購于美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染和分組 GES1、SNU-1、HS-746T 和AGS 均細胞采用添加10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)基置于37℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞80%融合時，加入胰酶消化細胞，用新鮮完全培養(yǎng)基按照1∶3 比例將細胞轉移至新的培養(yǎng)瓶傳代培養(yǎng)。將AGS 細胞接種6孔板，當細胞50%融合時，利用脂質體轉染試劑Lipofectamine2000將si-NC、si-LINC00680、miRNC、miR-431-5p mimics、si-LINC00680+anti-miR-NC、si-LINC00680+anti-miR-431-5p 分別轉染至 AGS 細胞，依次記為 si-NC 組、si-LINC00680 組、miR-NC 組、miR-431-5p 組、si-LINC00680+anti-miR-NC 組、si-LINC00680+anti-miR-431-5p 組，48 h 后收集細胞檢測轉染效果，合格后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 RT-qPCR 檢 測 LINC00680 和 miR-431-5p 表達 TRIzol 試劑提取 GES1、SNU-1、HS-746T 以及各組AGS 細胞總RNA。使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄以生成cDNA，利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ在熒光定量 PCR 儀上進行 RT-qPCR 反應，2-ΔΔCt公式計算LINC00680（內參為 β-actin）和miR-431-5p（內參為U6）相對表達量。LINC00680 上游引物5'-CCATC‐GACTGGCTCATCACAA-3'，下游引物5'-GGGGCAAGGCAAATCAATACC-3'；β-actin 上游引物 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3'，下 游 引 物 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'；miR-431-5p上游引物5′-TGTCTTGCAGGCCGTCATG-3′，下游引物 5′-GCTGTCAACGATACGCTACCTA-3′；U6 上游引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活力 每組取1×104個細胞接種 96 孔板，貼壁后每孔添加 10 μl 的 CCK-8 溶液。孵育2 h 后，空白孔歸零，采用酶標儀檢測實驗孔在450 nm的光密度（OD）值。

1.2.4 Transwell 實驗檢測細胞遷移和侵襲 用稀釋的基質膠包被Transwell 上腔室膜進行侵襲實驗。每組取1×104個AGS細胞接種Transwell上腔室中，加入200 μl無血清培養(yǎng)基。24孔板下室中加入500 μl含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基作為誘導劑。培養(yǎng)箱孵育24 h，棉簽除去基質膠和未過膜細胞。甲醇固定侵襲過膜的細胞，結晶紫染色15 min。顯微鏡觀察細胞，隨機選取5 個視野計數采用均數表示細胞侵襲數量。遷移實驗時采用未包被基質膠的小室，其他步驟與侵襲實驗一致。

1.2.5 Western blot 檢測 CyclinD1、MMP2、MMP9、E-Cadherin、N-Cadherin 和 Vimentin 蛋白表達 裂解各組細胞提取總蛋白。定量后，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離等量的蛋白，并利用濕法轉膜儀轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含5%脫脂牛奶緩沖液封閉膜后，將膜與一抗溶液（CyclinD1 和 MMP9 為 1∶1 000 稀釋，MMP2、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 為1∶500 稀釋）4℃下孵育12 h。隨后用稀釋的二抗孵育2 h。用增強的化學發(fā)光試劑盒檢測蛋白印跡，Image J 軟件分析目的蛋白相對表達量（內參β-actin）。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因實驗 構建含有miR-431-5p 結合位點的 LINC00680 野生型（WT）或突變型（MUT）片段，將其插入熒光素酶報告質粒pGL3獲 得 WT-LINC00680、MUT-LINC00680。 將 WTLINC00680、MUT-LINC00680 分 別 與 miR-431-5p mimics、miR-NC 分別共轉染至 AGS 細胞，48 h 后雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定共轉染細胞中的熒光素酶活性。將pcDNA-NC、pcDNA-LINC00680、si-NC、si-LINC00680 分別轉染至 AGS 細胞，48 h 后參照RT-qPCR步驟檢測miR-431-5p表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 每組設置3 個平行實驗，重復3 遍，計量資料以表示。采用 SPSS20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，t檢驗用于兩組間差異比較；單因素方差用于多組間差異比較，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胃癌細胞系中LINC00680 和miR-431-5p 表達情況 結果如圖1 所示，胃癌細胞系SNU-1、AGS、HS-746T 中LINC00680 表達量較人胃黏膜上皮永生細胞系GES1 顯著升高，miR-431-5p 表達量較GES1細胞系顯著降低（P<0.05）。

圖1 胃癌細胞系中miR-431-5p和LINC00680表達量Fig.1 Expression of miR-431-5p and LINC00680 in gas?tric cancer cell lines

2.2 抑制LINC00680 表達對AGS 胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 結果如表1 和圖2 所示，si-LINC00680 組 AGS 細 胞 LINC00680 表 達 量 較 si-NC組顯著降低（P<0.05），提示轉染 si-LINC00680 后AGS 細胞LINC00680 表達受到抑制。抑制LINC-00680 表達后，AGS 細胞活力、遷移和侵襲數量、Cy‐clinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達量均顯著降低（P<0.05）。

表1 抑制LINC00680表達對AGS胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00680 on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells（，n=9）

表1 抑制LINC00680表達對AGS胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.1 Effect of inhibiting LINC00680 on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells（，n=9）

Note：Compared with si-NC，1）P<0.05.

Cell invasion number（n）141.12±12.37 71.06±6.391）15.423 0.000 Groups LINC00680CyclinD1MMP2MMP9OD490 nm si-NC si-LINC00680 t P 1.00±0.10 0.36±0.041）17.827 0.000 0.98±0.10 0.48±0.051）13.416 0.000 0.84±0.08 0.35±0.031）17.205 0.000 0.78±0.07 0.33±0.031）17.726 0.000 1.02±0.10 0.48±0.041）14.958 0.000 Cell migration number（n）183.16±15.13 89.05±8.241）16.388 0.000

圖2 抑制LINC00680 表達對AGS 胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響Fig.2 Effect of inhibiting LINC00680 on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells

2.3 過表達miR-431-5p 對AGS 胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響 結果如圖3和表2所示，miR-431-5p組AGS細胞中miR-431-5p表達量較miR-NC 組顯著升高（P<0.05），提示轉染 miR-431-5p mimics 后AGS 細胞miR-431-5p 表達得到上調。過表達miR-431-5p 后，AGS 細胞活力、遷移和侵襲數量、Cy‐clinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達量均顯著降低（P<0.05）。

表2 過表達miR-431-5p對AGS胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.2 Effect of miR-431-5p overexpression on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells（，n=9）

表2 過表達miR-431-5p對AGS胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.2 Effect of miR-431-5p overexpression on proliferation，migration and invasion of AGS gastric cancer cells（，n=9）

Note：Compared with miR-NC，1）P<0.05.

Cell invasion number（n）140.93±10.76 61.09±5.691）19.678 0.000 Groups miR-431-5p CyclinD1MMP2MMP9OD490 nm miR-NC miR-431-5p t P 1.00±0.11 2.63±0.231）19.180 0.000 0.96±0.09 0.43±0.041）16.144 0.000 0.85±0.08 0.32±0.031）18.610 0.000 0.78±0.07 0.36±0.031）16.545 0.000 1.03±0.09 0.43±0.041）18.033 0.000 Cell migration number（n）182.69±15.06 80.26±7.361）18.332 0.000

圖3 Western blot 檢測 CyclinD1、MMP2 和 MMP9 蛋白的表達Fig.3 Western blot detects expressions of CyclinD1，MMP2 and MMP9 proteins

2.4 LINC00680 靶 向 miR-431-5p LncBase Pre‐dicted v. 2 網站在線預測結果見圖4A，miR-431-5p和LINC00680之間存在部分互補結合位點。雙熒光素酶活性檢測結果見圖4B，與miR-NC 和WTLINC00680 共轉染比較，miR-431-5p mimics 和 WTLINC00680共轉染后AGS細胞熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；與miR-NC和WT-LINC00680共轉染比較，miR-431-5p mimics 和 WT-LINC00680 共轉染后AGS 細胞熒光素酶活性變化無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 RT-qPCR 檢 測 結 果 見 圖 4C，pcDNALINC00680 組 AGS 細胞 miR-431-5p 表達量較 pcD‐NA-NC 組顯著降低（P<0.05）；si-LINC00680 組AGS細胞miR-431-5p 表達量較si-NC 組顯著升高（P<0.05）。

圖4 LINC00680靶向miR-431-5pFig.4 LINC00680 targets miR-431-5p

2.5 抑制miR-431-5p 可以逆轉抑制LINC00680 對AGS 增殖、遷移和侵襲的影響 結果如圖5 和表3所示，與si-LINC00680+anti-miR-NC 組比較，si-LINC00680+anti-miR-431-5p組AGS細胞miR-431-5p表達量顯著降低，細胞活力、遷移和侵襲細胞數、CyclinD1、MMP2 和MMP9 蛋白表達量顯著升高（P<0.05）。

表3 抑制miR-431-5p表達可以逆轉LINC00680低表達對AGS增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.3 Inhibiting miR-431-5p can reverse effect of LINC00680 inhibition on proliferation，migration and invasion of AGS（，n=9）

表3 抑制miR-431-5p表達可以逆轉LINC00680低表達對AGS增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.3 Inhibiting miR-431-5p can reverse effect of LINC00680 inhibition on proliferation，migration and invasion of AGS（，n=9）

Note：Compared with si-LINC00680+anti-miR-NC，1）P<0.05.

Cell invasion number（n）68.17±5.69 126.05±10.151）14.923 0.000 Groups miR-431-5p CyclinD1MMP2MMP9OD490 nm si-LINC00680+anti-miR-NC si-LINC00680+anti-miR-431-5p t P 1.00±0.11 0.35±0.031）17.103 0.000 0.49±0.05 0.90±0.091）11.947 0.000 0.36±0.03 0.79±0.071）16.939 0.000 0.32±0.03 0.72±0.071）15.757 0.000 0.49±0.04 0.89±0.081）13.483 0.000 Cell migration number（n）90.13±8.52 161.08±13.291）13.483 0.000

圖5 Western blot 檢測 CyclinD1、MMP2 和 MMP9 蛋白的表達Fig.5 Western blot detects expressions of CyclinD1，MMP2 and MMP9 proteins

2.6 EMT相關蛋白表達變化 結果如圖6所示，與si-NC 組比較，si-LINC00680 組 AGS 細胞 E-Cadherin蛋白表達顯著升高，N-Cadherin 和Vimentin 蛋白表達顯著降低；與si-LINC00680+anti-miR-NC 組比較，si-LINC00680+anti-miR-431-5p 組 AGS 細 胞 E-Cad‐herin 蛋白表達顯著降低，N-Cadherin 和 Vimentin 蛋白表達顯著升高（P<0.05）。

圖6 EMT的相關蛋白的表達變化Fig.6 Expression changes of EMT related proteins

3 討論

lncRNAs 涉及細胞分化、生長、凋亡、轉移等多種生物學過程，其表達改變與腫瘤的發(fā)生、轉移密切相關。研究顯示lncRNA 小核仁RNA 宿主基因1在胃癌組織中表達上調，與臨床病理分期、淋巴結轉移以及生存時間相關［8］。lncRNA 癌癥易感候選基因高表達參與胃癌細胞的體外增殖，遷移和侵襲［9］。lncRNA 肺腺癌轉移相關轉錄本1通過調節(jié)血管生成來促進胃癌的致瘤性和轉移［10］。這表明ln‐cRNA 在胃癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本研究重點研究LINC00680 在胃癌中的生物學作用，結果顯示，胃癌細胞中LINC00680表達水平顯著增加，轉染si-LINC00680 抑制 LINC00680 表達可降低 AGS 細胞的增殖、遷移和侵襲能力。CyclinD1 通過結合并激活細胞周期蛋白激酶促進細胞周期從G1期進入S期發(fā)揮促增殖作用［11］。MMP2 和 MMP9 在腫瘤的轉移中發(fā)揮主導作用，MMPs 表達增加與胃癌的侵襲轉移、淋巴結轉移有關，下調MMP2 和MMP9 表達可降低腫瘤細胞的侵襲轉移能力［12-13］。抑制LINC00680表達后 AGS 細胞 CyclinD1、MMP2 和 MMP9 蛋白表達均顯著降低，與功能分析結果一致。與本研究發(fā)現類似，抑制LINC00680 表達還可抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤生長，并促進細胞凋亡［5］。以上研究表明，LINC00680 在胃癌中具有致癌作用。

在腫瘤進展中，lncRNA-miRNA 相互作用參與其中并發(fā)揮關鍵作用。miR-431-5p 作為一種保守型非編碼RNA，已被證實在不同腫瘤中涉及許多生物學功能。研究顯示，lncRNA F-box 和富亮氨酸重復蛋白 19 反義 RNA1（FBXL19-AS1）通過靶向 miR-431-5p 參與肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和血管生成［14］。乳頭狀甲狀腺癌組織中miR-431-5p 表達降低，且具有淋巴結轉移的患者中miR-431-5p 表達更低［15］。過表達miR-431-5p 可抑制甲狀腺癌細胞、肺癌細胞的遷移和侵襲能力［16］。與上述研究類似，胃癌細胞中miR-431-5p 表達顯著降低，轉染miR-431-5p mimics 過表達 miR-431-5p 可降低 AGS 細胞的增殖、遷移和侵襲能力以及CyclinD1、MMP2 和MMP9蛋白表達水平。進一步分析顯示，LINC00680 對miR-431-5p 具有靶向負調控作用。此外，抑制miR-431-5p 表達可逆轉抑制 LINC00680 對 AGS 細胞增殖、遷移和侵襲的影響，進而恢復細胞的增殖、遷移和侵襲能力，這進一步說明LINC00680 直接靶向miR-431-5p進而參與胃癌進展。

EMT 是腫瘤細胞獲得更高的侵襲和轉移能力的關鍵步驟。在EMT 進程中，上皮細胞喪失其細胞極性、上皮標記物表達經歷表型轉換獲得間質表型，進而降低細胞間黏附力和增加侵襲轉移能力［17］。既往研究證實，lncRNA-TUG1 下調 miR-381促進EMT 進而促進胃癌細胞轉移［18］。此外，過表達miR-431-5p 顯著抑制肝癌和口腔鱗狀細胞癌進程［19-20］。本研究中，抑制 LINC00680 表達可降低AGS 細胞中間質標記物N-Cadherin 和Vimentin 表達水平，升高上皮標記物E-Cadherin表達水平，而抑制miR-431-5p 表達可逆轉抑制LINC00680 對 E-Cad‐herin、N-Cadherin 和 Vimentin 表達的影響，這表明LINC00680靶向miR-431-5p參與胃癌EMT過程。

綜上所述，胃癌中LINC00680 呈高表達。抑制LINC00680 可降低胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，抑制EMT 進程，其機制與靶向調控miR-431-5p表達有關。因此，LINC00680 有望成為胃癌治療的有效靶點。