劉 宇，王 莉，管桂坤，萬自然，夏培禹，袁 寧

（1.山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂277731； 2.臨沂市生態(tài)環(huán)境綜合執(zhí)法支隊(duì)羅莊大隊(duì)，山東臨沂276000）

俗話說“曲乃酒之骨”，充分說明了大曲在白酒釀造中的重要性[1]。大曲是含有多種微生物及酶系的混合菌劑，在釀酒過程中可通過人為強(qiáng)化多個有益優(yōu)質(zhì)種群來優(yōu)化白酒中風(fēng)味物質(zhì)的含量和比例，以提高白酒感官質(zhì)量和產(chǎn)量。酒醅是微生物發(fā)酵體系，質(zhì)量不同的酒醅可以蒸餾出不同風(fēng)味的白酒[2]，也就是說酒醅的揮發(fā)性物質(zhì)與白酒的風(fēng)味息息相關(guān)。近年來，對酒醅的研究主要集中在微生物區(qū)系的探索，較少有研究酒醅的揮發(fā)性成分[3-4]。因此，結(jié)合酒醅中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)解析醬香型白酒發(fā)酵過程，對于探究醬香型白酒發(fā)酵規(guī)律及風(fēng)味形成機(jī)理都具有十分重要的參考價值。

目前，頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法測定白酒或酒醅中微量揮發(fā)性成分的報道比較常見[5-7]。本試驗(yàn)研究了優(yōu)化后的醬香大曲強(qiáng)化工藝在釀酒過程中的發(fā)酵規(guī)律，采用HS-SPME-GC-MS測定方法對第四輪次酒醅中的揮發(fā)性香氣組分進(jìn)行了分析檢測，初步解析了蘭陵醬香型白酒發(fā)酵過程，這為研究功能微生物區(qū)系與白酒風(fēng)味間的聯(lián)系提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

樣品：取自山東蘭陵美酒股份有限公司醬香型白酒生產(chǎn)車間對照組和強(qiáng)化組第4輪次的酒醅和大曲，取樣時間點(diǎn)為堆積發(fā)酵0 d（1D0和2D0，前者為對照組，后者為強(qiáng)化組，下同）、堆積發(fā)酵2 d（1D2和 2D2）、窖內(nèi)發(fā)酵 0 d（1F0 和 2F0）、5 d（1F5和2F5）、10 d（1F10和2F10）、20 d（1F20和2F20）和出池酒醅（1FM和2FM），取三點(diǎn)混合樣迅速置于-20℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株：強(qiáng)化組醬香大曲添加了地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、宛氏擬青霉和米曲霉等5株功能微生物進(jìn)行了強(qiáng)化[8]，對照組不添加任何微生物。

儀器設(shè)備：安捷倫氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GC 6890N-MS 5975，Millipore-Q超純水系統(tǒng)，超聲波清洗器AS2060B。

1.2 試驗(yàn)方法

醬香酒醅中揮發(fā)性香氣物質(zhì)測定方法[9]如下，有所調(diào)整：

稱取4 g酒醅樣本，加入20 mL超純水，超聲波處理30 min，4℃靜置過夜。10000 r/min離心10 min取上清液8 mL，置于裝有3 g氯化鈉的頂空瓶中，加入8 μL薄荷醇內(nèi)標(biāo)（132.60 mg/L），用帶PTFE/藍(lán)色硅膠隔墊的空心磁性金屬蓋密封。

CTC萃取方法：采用2 cm的50/30 μm DVB/CAR/PDMS三相萃取頭，萃取溫度（孵化溫度）50℃，樣品平衡時間（孵化時間）5 min，萃取時間45 min，乳化器轉(zhuǎn)速（振搖速度）250 r/min，萃取深度22 mm，進(jìn)樣深度38 mm；萃取結(jié)束后將萃取頭置于GC進(jìn)樣口在250℃解吸附5 min（脫附時間300 s）。

GC條件：進(jìn)樣口和檢測器溫度均為250℃，隔墊吹掃流量3 mL/min，吹掃時間0.75 min，載氣為高純He，流速（色譜柱流量）為1.2 mL/min，進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣，色譜柱采用DB-FFAP（60 m×0.32 mm×0.25 μm，Agilent）。

柱箱升溫程序：溫度初始值50℃（平衡時間1 min，最高柱箱溫度250℃），保持2 min后，以4℃/min的速度升溫至230℃，保持時間15 min。

MS條件：以EI電離源為離子源，電離能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍35.00～350.00 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒醅揮發(fā)性物質(zhì)分布

酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)的量比關(guān)系是白酒質(zhì)量和風(fēng)格的關(guān)鍵因素，通過對醬香第四輪次酒醅的HSSPME-GC-MS檢測，按照物質(zhì)類別比較了對照組（圖1a）和強(qiáng)化組（圖1b）酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)分布情況。根據(jù)圖1可知，兩組揮發(fā)性物質(zhì)量比關(guān)系基本一致，絕大多數(shù)為酯類和醇類物質(zhì)，約占84.95%。

圖1 發(fā)酵過程中對照組(a)和強(qiáng)化組(b)酒醅揮發(fā)性物質(zhì)分布

吡嗪類物質(zhì)是重要的呈香呈味物質(zhì)，也是白酒的健康因子，有助于突出醬香型白酒的風(fēng)格特征。根據(jù)酒醅中吡嗪類物質(zhì)的HS-SPME-GC-MS檢測結(jié)果（圖2）可知，強(qiáng)化組的吡嗪類物質(zhì)明顯高于對照組，入池發(fā)酵5 d時強(qiáng)化組和對照組酒醅中的吡嗪類物質(zhì)分別為 199.51 μg/kg 和 162.89 μg/kg，前者約是后者的122.48%。另外，出池時，強(qiáng)化組酒醅中酯類物質(zhì)的含量稍高于對照組。

圖2 發(fā)酵過程中吡嗪類物質(zhì)含量的動態(tài)變化

2.2 酒醅揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜

通過HS-SPME-GC-MS檢測技術(shù)分析對照組和強(qiáng)化組第四輪次酒醅中的揮發(fā)性物質(zhì)，并應(yīng)用Morpheus在線軟件作熱圖分析（圖3），結(jié)果表明，對照組和強(qiáng)化組酒醅中揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量差別較大。

圖3 第四輪醬香酒醅揮發(fā)性物質(zhì)熱圖比較

酯類物質(zhì)是酒醅中種類最多、含量最高的揮發(fā)性化合物，共檢測出21種，其中強(qiáng)化組與對照組差別較大的香氣物質(zhì)主要有乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯、亞油酸乙酯和己酸乙酯等5種。一方面，乙酸苯乙酯呈玫瑰花甜香、威士忌酒香，苯乙酸乙酯蜂蜜香，琥珀酸二乙酯具有令人愉快的蘋果香和酒香，亞油酸乙酯有助于“掛杯”，呈現(xiàn)出獨(dú)特的臘腸香氣，強(qiáng)化組這4種物質(zhì)的相對含量明顯高于對照組，這有利于提高醬香型白酒的復(fù)合香氣強(qiáng)度和舒適度；另外，己酸乙酯是濃香型白酒典型香氣物質(zhì)，賦予酒體特有的窖香，強(qiáng)化組的己酸乙酯相對含量明顯低于對照組，這有利于凸顯醬香型白酒的風(fēng)格特點(diǎn)。

醇類物質(zhì)具有令人愉快的香氣，共檢測出7種，其中強(qiáng)化組與對照組差別較大的主要有2,3-丁二醇、3-辛醇和苯乙醇等3種。2,3-丁二醇具有奶油香和玫瑰花香，苯乙醇呈發(fā)悶的玫瑰香，強(qiáng)化組這2種物質(zhì)明顯高于對照組，賦予酒體醇甜感和馥郁的香氣；此外，3-辛醇似果仁香和蘑菇香，強(qiáng)化組的3-辛醇相對含量明顯低于對照組，這使得醬香型白酒更加醇厚豐滿。

有機(jī)酸類物質(zhì)為產(chǎn)酯提香提供前驅(qū)物質(zhì)，是調(diào)節(jié)白酒發(fā)酵過程和感官質(zhì)量的重要物質(zhì)，共檢測出7種，其中強(qiáng)化組與對照組差別較大的主要有苯甲酸和異戊酸等2種。苯甲酸呈現(xiàn)出令人愉悅的水果香和櫻桃香，強(qiáng)化組的苯甲酸明顯高于對照組；另外，異戊酸具有不愉快的氣味，強(qiáng)化組的異戊酸明顯低于對照組，這都賦予了醬香型白酒優(yōu)雅細(xì)膩的風(fēng)格特點(diǎn)。

雜環(huán)類物質(zhì)是醬香型白酒典型風(fēng)格特點(diǎn)的重要物質(zhì)支持，共檢測到15種。吡嗪類物質(zhì)是醬香型白酒重要的呈香呈味物質(zhì)，呈現(xiàn)出特殊的烘焙香，強(qiáng)化組的吡嗪類物質(zhì)明顯高于對照組，這有助于增強(qiáng)酒體的典型性；另外，4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚具有特殊的藥香、丁香和煙熏氣，強(qiáng)化組這3種物質(zhì)都明顯高于對照組，這也有利于凸顯醬香型白酒的典型性。

2.3 發(fā)酵過程解析

采用HS-SPME聯(lián)合GC-MS檢測技術(shù)對醬香型白酒發(fā)酵過程中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了半定量分析，獲得了酒醅揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜，結(jié)合發(fā)酵規(guī)律解析和醬酒感官質(zhì)量品評[10]，初步解析了醬香型白酒的發(fā)酵過程。

在堆積發(fā)酵階段，芽孢桿菌屬、有孢圓酵母屬、畢赤酵母屬、假絲酵母屬等生物量迅速增加，成為堆積過程的絕對優(yōu)勢菌；糠醇（焦香）、苯乙醇、乙基酯類物質(zhì)、吡嗪類物質(zhì)（烘焙香）和椰子醛（椰香、略有茴香，稀釋有杏李香）等物質(zhì)在堆積發(fā)酵過程中也迅速增加，使得堆積后的酒醅呈現(xiàn)出怡人的香氣。強(qiáng)化組揮發(fā)性物質(zhì)與對照組相比，亞油酸乙酯、苯甲酸、4-乙基愈創(chuàng)木酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚等香氣物質(zhì)明顯增加，推測強(qiáng)化大曲有助于推動這些物質(zhì)的代謝進(jìn)程。另外，堆積過程中有機(jī)酸類物質(zhì)整體減少。

窖內(nèi)發(fā)酵前期（0～10 d），由于溶氧量的大幅減少，細(xì)菌和芽孢桿菌的生物量一直增加，酵母和霉菌生物量有所減少，芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、畢赤酵母屬和有孢圓酵母屬為該階段的絕對優(yōu)勢菌；酯類和有機(jī)酸類物質(zhì)在該階段大量積累，酒醅香氣撲鼻、酒香馥郁。強(qiáng)化組的吡嗪類物質(zhì)含量明顯高于對照組，這說明強(qiáng)化大曲能有效促進(jìn)吡嗪類物質(zhì)的合成與積累。

窖內(nèi)發(fā)酵10 d后，細(xì)菌和酵母生物量增加，乳酸桿菌屬、畢赤酵母屬和有孢圓酵母屬是絕對優(yōu)勢菌；酯類和有機(jī)酸類物質(zhì)在該階段繼續(xù)積累，酒醅香氣濃郁、酒香舒適。強(qiáng)化組苯乙酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸己酯（梨香和蘋果香）、4-甲基愈創(chuàng)木酚（煙熏味）、4-乙基愈創(chuàng)木酚（藥香、煙熏味）、2,3,5,6-四甲基吡嗪（堅(jiān)果香、焙烤香）和椰子醛等物質(zhì)含量明顯高于對照組，推測強(qiáng)化大曲有利于提高這些物質(zhì)的代謝速度和增加物質(zhì)的積累。

綜上所述，使用強(qiáng)化大曲后，酒醅中的微生物種群結(jié)構(gòu)和演替規(guī)律發(fā)生復(fù)雜變化，從而有效促進(jìn)吡嗪類物質(zhì)、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、亞油酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸己酯、琥珀酸二乙酯、糠醇、苯甲酸和椰子醛等香氣物質(zhì)的合成與積累，凸顯出強(qiáng)化組醬香型白酒“醬香突出、優(yōu)雅細(xì)膩、酒體醇厚、空杯留香持久”的風(fēng)格特點(diǎn)。

3 結(jié)論

（1）吡嗪類物質(zhì)是醬香型白酒的特征成分，也是白酒的健康因子，有助于突出醬香型白酒的風(fēng)格特征。入池發(fā)酵5 d時強(qiáng)化組酒醅中的吡嗪類物質(zhì)含量最高，強(qiáng)化組的吡嗪類物質(zhì)明顯高于對照組，約是對照組的1.22倍。

（2）強(qiáng)化大曲可以有效調(diào)控醬香型白酒的發(fā)酵過程，促進(jìn)吡嗪類物質(zhì)、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對乙烯基愈創(chuàng)木酚、亞油酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸己酯、琥珀酸二乙酯、糠醇、苯甲酸和椰子醛等香氣物質(zhì)的合成與積累，從而提升了醬香型白酒的品質(zhì)。