許 波，袁鳳娟，楊?lèi)?ài)華，鄭 麗*

（1 江蘇省南通市婦幼保健院藥事科，南通 226018；2 新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市第一人民醫(yī)院分院藥劑科）

一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-components by a single marker，QAWS）是指以樣品中的某一成分（對(duì)照品易得且穩(wěn)定）為內(nèi)參物,建立該成分與其他成分的相對(duì)校正因子（relative correction factor，RCF）,通過(guò)RCF 計(jì)算其他成分的含量,適用于對(duì)照品獲得困難情況下的多成分同時(shí)測(cè)定[1]。九制大黃丸是以大黃藥材九蒸九曬加工而成,用于胃腸積滯所致的便秘、濕熱下痢、口渴不休、停食停水、胸?zé)嵝臒?、小便赤黃、頭痛目眩[2]。由于中藥材中成分種類(lèi)復(fù)雜,與測(cè)定單一成分相比,多指標(biāo)測(cè)定的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法更符合中藥特點(diǎn)[1，3]。多指標(biāo)測(cè)定必須有足夠多的對(duì)照品,但是由于有的對(duì)照品難以分離、單體不穩(wěn)定及價(jià)格昂貴等原因,使其獲得較困難[4-8]。QAWS 可在節(jié)約對(duì)照品的基礎(chǔ)上準(zhǔn)確有效地對(duì)藥物進(jìn)行質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 儀器 Dionex u3000 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000 RS 柱溫箱、DAD-3000 檢測(cè)器、Chromeleon 7 工作站）；Waters e2695 HPLC 儀（四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、脫氣裝置、2998PDA 檢測(cè)器、Empower工作站）；Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；Aglient TC-C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；H.H.S4 電熱恒溫水浴鍋；Willi-Q 超純水系統(tǒng)；Willipore 公司SK5200H 超聲波清洗器；Sartorius BT 25 S型電子天平。

1.2 對(duì)照品與樣品 蘆薈大黃素（批號(hào):110795-201007，純度98%）、大黃素甲醚（批號(hào):110758-201013，純度99.8%）（中國(guó)藥品生物制品檢定所）,大黃酸（批號(hào):110757-200206，純度≥98%）、大黃素（批號(hào):110756-200110，純度≥98%）、大黃酚（批號(hào):110796-201118，純度99.5%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）、九制大黃丸（河南宛東藥業(yè)有限公司）。

1.3 試劑 甲醇、乙腈均為色譜純、三氯甲烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、超純水（自制）。

1.4 色譜條件 Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0～10 min,5%～30%A;10～40 min，30%～60%A;40～60 min，60%A;60～70 min，60%～100%A;70～80 min，100%A）,流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm。

1.5 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取蘆薈大黃素3.01 mg、大黃酸4.50 mg、大黃素4.09 mg、大黃素甲醚7.99 mg 置于20 mL 容量瓶中,精密稱取大黃酚6.10 mg 置于10 mL 容量瓶中,加甲醇適量,使其溶解后加甲醇至刻度,搖勻,分別配置成5 個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取蘆薈大黃素儲(chǔ)備液6.4 mL、大黃酸儲(chǔ)備液6 mL、大黃素儲(chǔ)備液2 mL、大黃酚儲(chǔ)備液4 mL、大黃素甲醚儲(chǔ)備液1 mL,置于20 mL 容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,配置成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚濃度分別為0.048 2、0.067 5、0.409 0、0.122 0、0.399 5 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

1.6 樣品溶液制備 取本品適量,研細(xì),取約0.3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液5 mL,蒸干,加8%鹽酸溶液15 mL,超聲處理2 min,再加三氯甲烷10 mL,加熱回流1 h,放冷,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗滌容器,并入分液漏斗中,分取氯仿層,酸液再氯仿提取3 次,15 mL/次,合并氯仿層,蒸干。殘?jiān)蛹状既芙?置10 mL 量瓶中,加甲醇至刻度搖勻,過(guò)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)（10 μL 進(jìn)樣）,取續(xù)濾液,即得。

2 結(jié) 果

2.1 HPLC 含量測(cè)定方法的建立

2.1.1 樣品和混合對(duì)照品色譜圖“1.4”色譜條件下混合對(duì)照品和樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 樣品（A）和混合對(duì)照品（B）色譜圖

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算5 個(gè)成分的回歸方程及線性范圍,見(jiàn)表1～2。

表1 5 個(gè)成分的進(jìn)樣量和峰面積

表2 5 個(gè)成分回歸方程及線性范圍

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算6 次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)椎偏差（relative standard deviation，RSD）,結(jié)果表明儀器精密度良好,見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取樣品溶液10 μL,于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算6 次結(jié)果的RSD,結(jié)果表明樣品溶液在36 h 內(nèi)均穩(wěn)定,見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取6 份九制大黃丸粉末,每份約0.3 g,制備成6 個(gè)樣品溶液,各精密吸取10 μL進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算5 個(gè)蒽醌類(lèi)成分含量測(cè)定結(jié)果的RSD,結(jié)果表明樣品處理方法的重復(fù)性較好,見(jiàn)表5。

表5 重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

2.1.6 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品6 份,約0.15 g/份,精密稱定,分別置25 mL 具塞錐形瓶中,各精密加入混合對(duì)照品溶液10 mL 左右,再各加甲醇12 mL 左右,按“1.6”方法制成樣品溶液,測(cè)定并計(jì)算各成分的加樣回收率及RSD,見(jiàn)表6。

表6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 校正因子的計(jì)算 以大黃素為內(nèi)參物,取混合對(duì)照品溶液6 個(gè)進(jìn)樣體積折合成進(jìn)樣量（質(zhì)量）計(jì)算所得的RCF,取平均值作為定量用fs/i,并考察了7 個(gè)質(zhì)量點(diǎn)計(jì)算fs/i的RSD。RCF 計(jì)算公式[1]:fs/i=（Ws×Ai）/（Wi×As）,其中As為內(nèi)參物峰面積,Ws為內(nèi)參物質(zhì)量,Ai為某待測(cè)組分i 峰面積,Wi為某待測(cè)組分i 質(zhì)量。計(jì)算待測(cè)組分蘆薈大黃素（B）、大黃酸（C）、大黃酚（D）、大黃素甲醚（E）與內(nèi)參物大黃素（A）的RCF。結(jié)果表明,4 個(gè)待測(cè)組分與內(nèi)參物成分6 個(gè)質(zhì)量點(diǎn)計(jì)算fs/i的RSD 均<5%,見(jiàn)表7。

表7 4 個(gè)待測(cè)成分與大黃素的RCF

2.3 校正因子的重現(xiàn)性考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液10 μL,進(jìn)樣分析,在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別考察了Waters、Dionex 兩種HPLC 系統(tǒng)和Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Aglilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）兩種色譜柱對(duì)RCF 的影響,結(jié)果表明RSD 均<5%,表明在不同實(shí)驗(yàn)室、不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱下具有良好的重現(xiàn)性,見(jiàn)表8。

表8 不同儀器和色譜柱測(cè)定RCF

2.4 QAWS 與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較 分別精密吸取1～10 號(hào)樣品溶液各10 μL,注入HPLC 儀測(cè)定。采用外標(biāo)法（將各組樣品中5 個(gè)蒽醌成分的峰面積代入“2.1.2”中5 個(gè)成分回歸方程,計(jì)算出進(jìn)樣量,進(jìn)而根據(jù)進(jìn)樣體積求樣品中的量）測(cè)定5 個(gè)蒽醌成分的含量,再用建立的QAWS（根據(jù)“2.2”中RCF 計(jì)算公式）進(jìn)行含量計(jì)算,并比較相對(duì)誤差,結(jié)果表明,所有樣品蘆薈大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚這兩種方法所得結(jié)果相對(duì)誤差的絕對(duì)值基本<5%,提示建立的方法用于大黃素與其他4 種成分（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚）之間進(jìn)行含量測(cè)定具有較好的可信度,見(jiàn)表9。

由表9 可得本研究通過(guò)測(cè)定大黃素與其他4 個(gè)成分（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚）之間的RCF 等方法最終確立的一測(cè)多評(píng)法具有良好的穩(wěn)定性、可行性,可用于九制大黃丸中5 種成分的含量測(cè)定,為該中成藥的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

表9 QAWS 與外標(biāo)法測(cè)得的5 個(gè)蒽醌含量 mg/g

3 討 論

3.1 內(nèi)參物的選擇 大黃素出峰順序居中且與其他4 種成分分離度較高,對(duì)照品易獲得,故選大黃素作為內(nèi)參物[5]。3.2 色譜峰的定位 有學(xué)者[9]采用對(duì)照品建立線性方程,進(jìn)行待測(cè)成分色譜峰定位,考察不同線性回歸法在不同色譜柱上對(duì)待測(cè)組分色譜峰定位。本實(shí)驗(yàn)采用的是對(duì)照品色譜峰的比對(duì)定位。

3.3 QAWS 的優(yōu)缺點(diǎn) 該方法可解決在針對(duì)藥材質(zhì)量控制方面對(duì)照品難以分離、單體不穩(wěn)定及價(jià)格昂貴等問(wèn)題,但是某些藥材成分會(huì)因產(chǎn)地不同等因素而導(dǎo)致個(gè)別成分含量差異巨大,此時(shí)該方法適用面可能覆蓋不到含量差異巨大的成分。

3.4 應(yīng)用前景 本研究建立了QAWS,更加簡(jiǎn)潔、快速、經(jīng)濟(jì)、有效地實(shí)現(xiàn)了九制大黃丸中5 種蒽醌類(lèi)成分的含量測(cè)定。《中國(guó)藥典》2015 年版一部將一測(cè)多評(píng)法作為中藥質(zhì)量控制的重點(diǎn)推廣技術(shù)并應(yīng)用于丹參、生姜、黃連等藥材,銀杏葉提取物及制劑銀杏葉片、銀杏葉膠囊、銀杏葉滴丸,咳特靈片、咳特靈膠囊等的質(zhì)量控制?！睹绹?guó)藥典》34 版、《歐洲藥典》7.0 版中也分別有25 個(gè)和9 個(gè)天然藥物及制劑應(yīng)用該方法進(jìn)行質(zhì)量控制。該方法極大地縮減了藥學(xué)工作中所需花費(fèi)的人力物力,并可有效地對(duì)藥物進(jìn)行質(zhì)量控制[10]。