周 虹，錢(qián)金鋒*，楊其昌，張曉娟，桑秋霞

（南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科，南通 226001）

2018 年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,女性新發(fā)乳腺癌209 萬(wàn)例,死亡63 萬(wàn)例,發(fā)病率位居全球第二,死亡率位居全球第五,乳腺癌占女性癌癥的首位[1]。含sushi 重復(fù)蛋白X 連鎖2（sushi repeat containing protein X-linked 2，SRPX2）基因是H.KUROSAWA 等[2]于1999 年首次在白血病細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的,對(duì)細(xì)胞黏附及血管生成有非常重要的作用[3]。研究[4]發(fā)現(xiàn),SRPX2參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,與腫瘤的侵襲與遷移密切相關(guān)。但SRPX2 在乳腺癌組織中的表達(dá)及對(duì)預(yù)后的影響尚不清楚。本研究對(duì)SRPX2 的表達(dá)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密度（lymph node metastasis density，ND）[5]與乳腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行分析,旨在為SRPX2 作為乳腺癌治療新靶點(diǎn)提供一定的研究依據(jù),對(duì)乳腺癌患者預(yù)后價(jià)值提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2004 年1 月—2006 年12 月在南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院經(jīng)病理確診的女性乳腺癌患者標(biāo)本110 例,年齡32～84 歲,平均51 歲；按照WHO 世界衛(wèi)生組織第五版乳腺癌分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[6]:浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌100 例,其他特殊類(lèi)型10 例；TNW 分期:Ⅰ～Ⅱ期68 例,Ⅲ～Ⅳ期42 例；發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53 例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57 例；腫瘤最大直徑:≤2 cm 45 例,＞2 cm 65 例。本研究經(jīng)南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 組織芯片技術(shù)及免疫組織化學(xué)方法 選取乳腺癌組織HE 切片及對(duì)應(yīng)的乳腺癌組織蠟塊,用顯微鏡觀察其HE 染色結(jié)果,定位腫瘤在HE 玻片上的位置。然后,在蠟塊標(biāo)本上找到相應(yīng)位置加以標(biāo)記,通過(guò)組織芯片制作機(jī)將具有代表性的組織制成芯片蠟塊,連續(xù)切片,進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。本研究采用EnVision 染色法[7],所用試劑SRPX2 為兔抗人單克隆抗體（Anti-SRPX2）,購(gòu)自Sweden Atlas 公司,工作濃度為1∶20。

1.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比進(jìn)行半定量分析[7]。用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照。染色強(qiáng)度判讀標(biāo)準(zhǔn):3 分（強(qiáng)著色）、2分（中等度著色）、1 分（弱著色）、0 分（無(wú)著色）。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù):3 分（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞70%）、2 分（＞30%～70%）、1 分（＞1%～30%）、0 分（無(wú)細(xì)胞）。將兩項(xiàng)計(jì)分累加,4～6 分為高表達(dá)組,0～3 分為低表達(dá)組。ND 為切除的陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)與切除的淋巴結(jié)總數(shù)之比,分為:0 組、≤40%組、＞40%組[8]。

1.4 隨訪(fǎng)方法 患者術(shù)后2 年內(nèi)每3 個(gè)月隨訪(fǎng)1次,3～6 年每6 個(gè)月隨訪(fǎng)1 次,6 年以后每年隨訪(fǎng)1次。隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2019 年12 月31 日。110 例乳腺癌患者中失訪(fǎng)15 例,死于乳腺癌48 例,隨訪(fǎng)時(shí)間32～179 個(gè)月,中位隨訪(fǎng)時(shí)間（117±34.91）個(gè)月。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,相關(guān)性采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析法,計(jì)數(shù)資料采用雙側(cè)χ2檢驗(yàn),生存曲線(xiàn)采用Kaplan-Meier 方法,比較運(yùn)用Log-rank 檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌中SRPX2 的表達(dá)及ND 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,SRPX2 陽(yáng)性細(xì)胞著色主要定位于細(xì)胞質(zhì),高表達(dá)72 例,低表達(dá)38 例（圖1）。本組患者切除淋巴結(jié)10～21 枚,平均（15±3.75）枚,其中陽(yáng)性淋巴結(jié)1～20 枚,平均（6±6.01）枚。ND:0 組57 例,≤40%組29 例,＞40%組24 例。

圖1 SRPX2 在乳腺癌組織中的表達(dá)

2.2 乳腺癌中SRPX2 及ND 與患者臨床病理特征的關(guān)系 乳腺癌組織中SRPX2 高表達(dá)及ND＞40%與患者TNW 分期及HER-2 的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（均P<0.05）,與其他臨床病理特征均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）,見(jiàn)表1。

表1 乳腺癌中SRPX2 的表達(dá)及ND 與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 乳腺癌中SRPX2 的表達(dá)與ND 的相關(guān)關(guān)系SRPX2 低表達(dá)組中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移6 例（15.8%）,高表達(dá)組中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47 例（65.3%）。結(jié)果顯示,SRPX2 表達(dá)愈強(qiáng),ND 就愈高,SRPX2 的高表達(dá)與ND＞40%呈正相關(guān)（rs=0.494，P<0.001）,見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌中SRPX2 的表達(dá)與ND 之間的關(guān)系

2.4 乳腺癌中SRPX2 的表達(dá)及ND 與預(yù)后的相關(guān)性 SRPX2 高表達(dá)患者病死率為65.6%（40/61）,低表達(dá)患者病死率為23.5%（8/34）,SRPX2 高表達(dá)組與低表達(dá)組患者生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.439，P<0.001）。ND=0 組、ND≤40%組及ND＞40%組患者病死率分別為30.8%（16/52）、65.2%（15/23）及85.0%（17/20）。ND 不同組之間生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.614，P<0.001）,見(jiàn)圖2。

圖2 SRPX2 的表達(dá)和ND 對(duì)乳腺癌患者的預(yù)后影響

3 討 論

SRPX2 基因是E2A-HLF 融合基因的下游靶基因,由465 個(gè)氨基酸殘基組成,包括1 個(gè)DUF4174結(jié)構(gòu)域、3 個(gè)sushi 重復(fù)結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)hyaline 重復(fù)結(jié)構(gòu)域。SRPX2 是一種硫酸軟骨素蛋白聚糖,蛋白聚糖是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECW）的主要組成部分,在維持組織穩(wěn)態(tài)方面起著生理作用。在腫瘤微環(huán)境中,蛋白多糖的表達(dá)發(fā)生變化,從而影響腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路,在腫瘤生長(zhǎng)、遷移和血管再生方面發(fā)揮多種功能,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[9]。SRPX2 是尿激酶型纖溶酶原激活物受體（urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR）配體中的一種,在心、肺、腦等組織中均有所表達(dá)[10],生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,SRPX2 通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的uPAR 促進(jìn)微血管的生成。研究[11]發(fā)現(xiàn)SRPX2 能夠與金屬蛋白酶ADAWTS4、uPAR 和半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶B 結(jié)合,影響ECW 蛋白的水解。隨著ECW 結(jié)構(gòu)的改變,細(xì)胞的遷移與侵襲能力增強(qiáng)[12]。異常ECW 通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞遷移與侵襲影響腫瘤的進(jìn)展,并促進(jìn)腫瘤炎癥反應(yīng)和血管生成[13]。

SRPX2 在胃腸道腫瘤中過(guò)度表達(dá),其與腫瘤細(xì)胞表面的uPAR 結(jié)合,腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力增強(qiáng),并增加黏附激酶的磷酸化,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移能力[14]。在前列腺癌中,SRPX2 高表達(dá)與Gleason 評(píng)分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),且與低生存率密切相關(guān)[15]。在肝癌中抑制SRPX2 的表達(dá)后,肝癌細(xì)胞的侵襲與遷移能力下降[16]。提示在惡性腫瘤中,SRPX2 可能作為致癌基因發(fā)揮作用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中SRPX2 的高表達(dá)TNW 分期有關(guān),在Ⅲ～Ⅳ期中表達(dá)高于Ⅰ～Ⅱ期,與在肝癌組織[15]中的研究一致。另外,本研究發(fā)現(xiàn)SRPX2 的表達(dá)與HER-2 陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān),并與乳腺癌ND 相關(guān),在SRPX2 高表達(dá)組中ND 明顯高于低表達(dá)組,而與其他臨床病理因素?zé)o關(guān),可見(jiàn)SRPX2 與乳腺癌異常增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Log-rank 檢驗(yàn)表明SRPX2 高表達(dá)組患者生存率明顯低于低表達(dá)組,與前列腺癌[15]的研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn),SRPX2 的過(guò)表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移受多種因素共同影響,預(yù)后與各臨床病理特征之間的關(guān)系在各項(xiàng)研究中也有所不同[17]。其中,評(píng)估原發(fā)性乳腺癌患者治療和預(yù)后的重要因素之一即術(shù)后腋窩淋巴結(jié)情況[18],國(guó)際上主要依據(jù)AJCC/UICC[19]提出的陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目的N 分期來(lái)評(píng)價(jià)乳腺癌的淋巴結(jié)情況,雖然簡(jiǎn)單、直觀,但受淋巴結(jié)清除程度的影響。ND 是切除的陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)與切除的淋巴結(jié)總數(shù)之比,它已被認(rèn)為是許多類(lèi)型癌癥的預(yù)后因素[20],能較好地評(píng)估乳腺癌患者的無(wú)瘤生存時(shí)間[21]。在陰莖癌[22]中,ND＞15%與無(wú)瘤生存率和總生存率降低有關(guān),是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,優(yōu)于陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)目的評(píng)估。在口腔鱗狀細(xì)胞癌肺轉(zhuǎn)移的研究[23]中,ND＞7%與低生存率有關(guān)；K.YAWASHITA 等[5]研究表明,ND 在同一分期胃癌中有較好的預(yù)后分層,ND＞40%被認(rèn)為是不可治愈因子,因其在Ⅲ期和Ⅳ期胃癌中提示相同的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組織中ND 與TNW 分期及HER-2 的陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān),與其他臨床病理因素?zé)o關(guān),并且隨著ND 的增加,患者無(wú)瘤生存率降低,提示ND 可以作為患者預(yù)后不良的一個(gè)因素,對(duì)臨床治療和預(yù)后評(píng)估具有重要的影響。

綜上所述,細(xì)胞外基質(zhì)蛋白SRPX2 及ND 與乳腺癌的侵襲和預(yù)后密切相關(guān),聯(lián)合檢測(cè)有助于判斷乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和患者的預(yù)后。