顧思源，陳 曄，施曉健，王友華*

（1 南通大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，南通 226001；2 南通大學(xué)附屬海門醫(yī)院骨科）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變、軟骨骨化以及繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性疾病[1-2]。OA 最常累及膝關(guān)節(jié),導(dǎo)致關(guān)節(jié)嚴(yán)重畸形、關(guān)節(jié)功能障礙,嚴(yán)重者可致殘,直接影響中老年人的生活質(zhì)量[1，3]。OA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,炎癥因子、代謝等因素均與OA 密切相關(guān)。軟骨細(xì)胞作為軟骨的唯一細(xì)胞成分,是OA 發(fā)生發(fā)展過程中主要累及的細(xì)胞損傷類型。研究[4]表明,軟骨細(xì)胞損傷可分為細(xì)胞壞死、凋亡和自噬細(xì)胞死亡等方式。2012 年,S.J.DIXON 等[5]首次報(bào)道了一種新的細(xì)胞調(diào)控死亡形式,它在形態(tài)、生化和基因上都不同于其他形式的細(xì)胞死亡,并將其命名為鐵死亡。鐵死亡是一種鐵依賴的非凋亡性細(xì)胞死亡,其特征是抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶4 失活和脂質(zhì)活性氧積累。迄今為止,鐵死亡被證實(shí)與許多退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ　⑴两鹕?、腎臟變性）、癌變、腦出血、創(chuàng)傷性腦損傷、缺血再灌注損傷和腦卒中有關(guān)[6]。然而,目前關(guān)于鐵死亡在OA 進(jìn)展中的研究甚少。本研究利用生物信息學(xué)挖掘有效的GEO 數(shù)據(jù),篩選出OA 和正常志愿者軟骨組織差異mRNA,并利用軟件對(duì)高表達(dá)的差異基因做京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析,篩選出鐵死亡相關(guān)的差異基因；然后利用正常膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本,中期、晚期OA 患者軟骨標(biāo)本驗(yàn)證上述鐵死亡相關(guān)差異基因血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HWOX1）的表達(dá)。HWOX1 是血紅素分解代謝的一種必需酶,在鐵死亡中扮演著雙重作用。一方面,作為細(xì)胞保護(hù)酶,能顯著減輕erastin 誘導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞鐵死亡[7]；另一方面,高表達(dá)的HWOX1 可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞等發(fā)生鐵死亡[8-9]。然而,關(guān)于HWOX1 在OA 軟骨細(xì)胞及組織中的表達(dá)研究較少。本研究將有助于從鐵死亡的角度為OA 的發(fā)病機(jī)制提供更多理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 GEO 芯片數(shù)據(jù)檢索與分析 在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）平臺(tái)下的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO（http://www.ncbi.nlm.gov/geo/）中,檢索含有OA軟骨組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù),選取并下載GSE114007 的基因表達(dá)數(shù)據(jù)[10]。GSE114007 信息:GPL11154 Illumina HiSeq 2000 以及Illumina NextSeq 500 高通量測(cè)序平臺(tái),包含8 例正常人及10 例OA 患者關(guān)節(jié)軟骨組織的mRNA 表達(dá)陣列數(shù)據(jù)。下載數(shù)據(jù)為count值表達(dá)矩陣,用R（v3.6.1）語言DESeq2（v1.25.16）包以log（FC）絕對(duì)值＞1,P<0.05 為標(biāo)準(zhǔn),對(duì)mRNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因分析。

1.2 基因功能富集和注釋 為闡明差異基因參與的生物學(xué)進(jìn)程,利用WebGestalt 網(wǎng)站（http://www.webgestalt.org）對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析,尋找差異表達(dá)基因所富集的關(guān)鍵通路。

1.3 Western Blot 所用6 例OA 患者關(guān)節(jié)軟骨來自膝關(guān)節(jié)置換術(shù)且符合OA 分期,3 例正常關(guān)節(jié)軟骨樣本來自截肢的正常膝關(guān)節(jié)。本研究得到了南通大學(xué)附屬海門醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。將所得軟骨組織剪碎,液氮中研磨并加入蛋白裂解液充分裂解蛋白,離心后取上清。BCA 蛋白濃度檢測(cè)法測(cè)定蛋白濃度,配制聚丙烯酰胺凝膠,電泳分離蛋白樣品,接著,在標(biāo)準(zhǔn)濕式轉(zhuǎn)膜裝置中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。孵育1∶1 000 的抗HWOX1 的兔單克隆抗體（Cell Signaling Technology，WA，USA）,4 ℃過夜。室溫中孵育抗兔IgG 2 h,手動(dòng)X 感光膠片顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0 以及Graphpad prism 6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示,組內(nèi)比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn),組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3 次以上,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GEO 數(shù)據(jù)檢索、預(yù)處理及OA 患者關(guān)節(jié)軟骨組織差異基因分析 GSE114007 的軟骨組織mRNAseq 表達(dá)矩陣分析結(jié)果顯示,OA 患者與正常人關(guān)節(jié)軟骨組織共有2 694 個(gè)差異基因,其中1 304 個(gè)基因在OA 患者軟骨組織中高表達(dá),1 390 個(gè)基因低表達(dá)（圖1A）。KEGG 富集分析結(jié)果顯示,高表達(dá)基因顯著富集在細(xì)胞黏附、礦物質(zhì)吸收、細(xì)胞鐵死亡等通路（圖1B）。

圖1 OA 患者與正常人關(guān)節(jié)軟骨組織差異基因分析

2.2 正常人與OA 患者關(guān)節(jié)軟骨組織中高表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因比較 OA 患者高表達(dá)的基因中,有7個(gè)與鐵死亡相關(guān)（表1）。

表1 正常人與OA 患者關(guān)節(jié)軟骨中高表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因mRNA-seq 均值的比較

2.3 OA 患者與正常人關(guān)節(jié)軟骨組織中HWOX1 蛋白的表達(dá)結(jié)果 HWOX1 在中期及晚期OA 患者軟骨標(biāo)本中表達(dá)增高,晚期顯著高表達(dá),而正常膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本中低表達(dá)。HWOX1表達(dá)隨OA 病程嚴(yán)重程度的增加而升高（圖2）。

圖2 OA 患者與正常人關(guān)節(jié)軟骨組織中HWOX1 蛋白表達(dá)驗(yàn)證

3 討 論

OA 是最常見的關(guān)節(jié)疾病,發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。既往研究[4]表明,軟骨細(xì)胞壞死、凋亡和自噬細(xì)胞死亡是OA 發(fā)生的重要原因。因此,抑制鐵死亡是一種新穎而有前景的治療方法。然而,鐵死亡是否與OA 進(jìn)展相關(guān)目前還不清楚,參與鐵死亡的相關(guān)基因是否在OA 中表達(dá)異常也缺乏研究。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)挖掘GEO 數(shù)據(jù)庫中的GSE114007 數(shù)據(jù),篩選出OA 和正常人軟骨組織差異表達(dá)的mRNA。利用軟件對(duì)高表達(dá)的差異基因進(jìn)行富集分析,篩選出鐵死亡相關(guān)的差異基因。通過進(jìn)一步驗(yàn)證,明確鐵死亡相關(guān)基因HWOX1 在中期、特別是晚期OA 患者軟骨標(biāo)本中表達(dá)顯著增高,在OA 發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

通過分析GSE114007 芯片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),OA 和正常人軟骨組織具有不同的mRNA 表達(dá)模式,兩組之間共存在2 694 個(gè)差異基因,其中1 304 個(gè)基因在OA 患者軟骨組織中高表達(dá),1 390 個(gè)基因低表達(dá)。提示這些異常表達(dá)的mRNA 可能參與并促進(jìn)OA 的臨床進(jìn)展。通過對(duì)差異表達(dá)的基因做KEGG 富集分析,進(jìn)一步闡明鐵死亡相關(guān)基因HWOX1 在OA 患者軟骨組織中高表達(dá)。HWOX1 由于在鐵死亡中扮演“促進(jìn)”與“抑制”的雙重作用而受到關(guān)注[7-9，11]。本研究表明,HWOX1 表達(dá)隨OA 病程嚴(yán)重程度的增加而升高,可能參與OA 的病程進(jìn)展。