陳 云，龔偉偉，鐘素芬，孟國梁*

（南通大學(xué)藥學(xué)院，南通 226001）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DW）是一種常見的代謝性疾病,目前全世界成人DW 患者約4.63 億,預(yù)計(jì)到2045 年將增至6.93 億[1]。DW 患者長期高血糖會引發(fā)多種并發(fā)癥,其中糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCW）是一種常見的心血管并發(fā)癥,可出現(xiàn)獨(dú)立于冠狀動脈粥樣硬化、高血壓和其他心血管危險(xiǎn)因素以外的心臟結(jié)構(gòu)和功能異常,主要表現(xiàn)為心肌僵硬、心肌纖維化、肥厚,造成心臟舒張功能障礙和收縮功能受損[2],但尚缺乏行之有效的治療方法。

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DHY）是藤茶中含量最豐富的天然黃酮類化合物,具有多種藥理學(xué)作用[3]。DHY 能提高果蠅應(yīng)激耐受性,減緩腸道功能障礙,延長果蠅壽命[4]；促進(jìn)自噬,減輕DW 腎間質(zhì)纖維化[5]；抑制動脈粥樣硬化斑塊形成,促進(jìn)脂質(zhì)代謝,延緩載脂蛋白E 敲除小鼠的動脈粥樣硬化進(jìn)展[6],然而,DHY 能否保護(hù)DCW 尚不明確。本研究旨在探討DHY 對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的小鼠DCW 的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 8 周齡雄性C57BL/6 小鼠購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（動物倫理編號:S20200323-095）。STZ購自美國Sigma-Aldrich 公司,DHY（純度＞98%）購自西安天豐生物科技有限公司,羧甲基纖維素鈉（carboxymethycellulose，CWC）購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司,去乙?；?（sirtuin 3，SIRT3）抗體和受體相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein kinase 3，RIPK3）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DW 小鼠模型構(gòu)建 小鼠禁食12 h,腹腔注射STZ 60 mg/（kg·d-1）,連續(xù)5 d,對照組（control 組）小鼠腹腔注射等量的枸櫞酸鹽緩沖液。尾靜脈取血,利用One-Touch 血糖儀測定小鼠空腹血糖,＞16.7 mmol/L為DW 組。2 周后,小鼠予溶于0.5% CWC 的DHY 250 mg/（kg·d-1）灌胃,對照組予等量的0.5%CWC,持續(xù)12 周。實(shí)驗(yàn)期間每2 周定期測定小鼠空腹血糖。

1.2.2 糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）測定 小鼠眼球取血,1 000 r/min 離心10 min,沉淀即為紅細(xì)胞。然后用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞以制備溶血液,酸化后100 ℃加熱水解1 h,加入蛋白沉淀劑渦旋混勻后,3 500 r/min 離心10 min,取上清,加入顯色劑,40 ℃水浴保溫30 min,冷卻后于443 nm 處測吸光度值,計(jì)算HbA1c 含量。

1.2.3 超聲心動圖測定 小鼠用異氟烷（1%～2%）麻醉后,使用Visual Sonic Vevo 2100 型小動物超聲成像系統(tǒng)經(jīng)胸骨長軸視圖檢測心臟構(gòu)型,使用W 型超聲心動圖記錄圖像,測量射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S）。取心尖四腔切面,多普勒取樣容積置于二尖瓣下,聲束與室間隔平行,獲得心室舒張期E 峰和A 峰血流,計(jì)算舒張期E 峰與A 峰比值（E/A 值）。

1.2.4 丙二醛（malondialdehyde，WDA）測定 取30 mg心肌組織加入300 μL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）進(jìn)行勻漿；4 ℃,12 000 r/min 離心10 min,棄沉淀,吸取上清備用。按說明書要求制備檢測體系,利用酶標(biāo)儀在532 nm 測定各樣品吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算心肌組織WDA 水平。

1.2.5 總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）檢測 取20 mg 心肌組織加入100 μL 預(yù)冷的PBS勻漿,4 ℃,12 000 r/min 離心5 min,吸取上清液備用。按說明書要求制備檢測體系,利用酶標(biāo)儀在593 nm處檢測各孔吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算心肌組織T-AOC。

1.2.6 蛋白印跡（Western Blot）取左心室組織塊30 mg,洗凈吸干,加入300 μL 蛋白裂解液。剪碎組織塊勻漿后,置于冰上裂解40 min。4 °C 12 000 r/min 離心15 min,取上清,BCA 法測定蛋白濃度,加入上樣緩沖液煮沸5 min,保存?zhèn)溆?。蛋白樣品?jīng)十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂牛奶封閉后,分別用SIRT3（1∶1 000）和RIPK3（1∶1 000）一抗4 °C 孵育過夜,換用二抗室溫下孵育2 h。滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影液顯像,Image J 分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,使用Stata 13.0 軟件,采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）及Bonferroni post hoc 檢驗(yàn)進(jìn)行比較,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DHY 對DW 小鼠空腹血糖和HbA1c 水平的作用 與control 組相比,小鼠腹腔注射STZ 后空腹血糖濃度均＞16.7 mmol/L,HbA1c 水平升高,提示成功構(gòu)建DW 模型；DHY 治療12 周后顯著降低DW 小鼠空腹血糖和HbA1c 水平（圖1）。

圖1 DHY 對糖尿病小鼠血糖和HbA1c 的影響

2.2 DHY 對DW 小鼠心功能的影響 與control 組相比,DW 小鼠EF、FS 和E/A 均顯著降低,提示DW小鼠心臟收縮和舒張功能障礙,出現(xiàn)典型的DCW 癥狀；DHY 治療后顯著增加EF、FS 和E/A,改善DW小鼠心臟收縮和舒張功能（圖2）。

圖2 DHY 對DW 小鼠心功能的影響

2.3 DHY 對DW 小鼠心肌氧化應(yīng)激的影響 與control 組相比,DW 小鼠心肌WDA 水平顯著升高,T-AOC 顯著降低,提示DW 小鼠心肌組織氧化應(yīng)激損傷加重；DHY 治療后,小鼠心肌WDA 水平降低,T-AOC 升高,表明DHY 能減輕DW 小鼠心肌的氧化應(yīng)激損傷（圖3）。

圖3 DHY 對DW 小鼠心肌氧化應(yīng)激的影響

2.4 DHY 對DW 小鼠心肌SIRT3 和RIPK3 蛋白表達(dá)的作用 與control 組相比,DW 小鼠心肌SIRT3表達(dá)降低,RIPK3 表達(dá)升高；DHY 治療后明顯增加SIRT3 表達(dá),抑制DW 小鼠心肌RIPK3 的表達(dá)（圖4）。

圖4 DHY 對DW 小鼠心肌SIRT3 和RIPK3 蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

STZ 是一個對胰島β 細(xì)胞具有高度選擇性的毒性物質(zhì),能干擾葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),影響葡萄糖激酶的功能,促進(jìn)胰島細(xì)胞DNA 甲基化和DNA 鏈斷裂,破壞胰島β 細(xì)胞并導(dǎo)致胰島素分泌不足,誘導(dǎo)產(chǎn)生DW[7]。DHY 是從顯齒蛇葡萄莖和葉中分離出的一種黃酮類化合物,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護(hù)心臟、清除自由基等作用[3]。值得注意的是,DHY 可激活小鼠前脂肪胚胎成纖維細(xì)胞中的過氧化物酶體增殖物激活受體γ,改善胰島素抵抗[8]；DHY 也可上調(diào)心肌組織中胰島素受體底物-1 的磷酸化水平,改善（Lepr）KO/KO（db/db）小鼠的代謝紊亂和胰島素抵抗[9],這可能也是本研究中DHY 抑制STZ 誘導(dǎo)DW 小鼠血糖濃度和HbA1c 水平,進(jìn)而改善心功能的主要原因。

DHY 通過抗氧化作用發(fā)揮藥理作用,比如DHY抑制氧化應(yīng)激減輕HT22 細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧損傷[10],通過下調(diào)miR-34a 減輕高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激[11],減輕DW 小鼠胸主動脈氧化應(yīng)激水平[12]。由于DW 患者持續(xù)的高血糖引起活性氧過量產(chǎn)生,從而在DCW 中發(fā)揮重要作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)DHY 降低DCW 小鼠心肌WDA 水平,T-AOC 升高,提示DHY 減弱DCW 小鼠心肌氧化應(yīng)激水平,這可能是DHY 抗DCW 的重要機(jī)制之一。

DHY 抗氧化應(yīng)激的確切機(jī)制尚不清楚。本課題組既往研究[12]發(fā)現(xiàn),DHY 依賴增加血管組織中SIRT3表達(dá)進(jìn)而減輕氧化應(yīng)激,并改善DW 小鼠胸主動脈內(nèi)皮依賴性舒張功能。SIRT3 是一種位于線粒體內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白去乙酰化酶,調(diào)節(jié)線粒體呼吸、三磷酸腺苷合成、氧自由基生成及清除等過程。SIRT3 可通過調(diào)節(jié)叉頭蛋白3a（forkhead-box-protein 3a，F(xiàn)OXO3a）和超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）等靶蛋白去乙?；揎?降低WDA,增強(qiáng)T-AOC,抑制體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[7，14]。相反,SIRT3 缺失可促進(jìn)氧化應(yīng)激,加重DW心肌損傷[7]。因此,DHY 增加DCW 小鼠心肌中SIRT3表達(dá),可能是DHY 減輕氧化應(yīng)激、改善DCW 的重要機(jī)制之一。

壞死性凋亡作為一種新近發(fā)現(xiàn)的可調(diào)控的細(xì)胞壞死,在心肌缺血再灌注、肺炎鏈球菌感染引起的心臟損傷、動脈粥樣硬化等心血管疾病中發(fā)揮重要作用[15]。RIPK3 作為壞死性凋亡信號通路中的核心分子,表達(dá)增加是壞死性凋亡的重要標(biāo)志之一[16]。RIPK3 升高后,磷酸化RIPK1,進(jìn)而通過RIPK 同型相互作用基序相結(jié)合形成一種信號復(fù)合物,即壞死性小體,激活混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain like protein，WLKL）多個位點(diǎn)磷酸化,促進(jìn)形成二硫鍵依賴的WLKL 聚合物,形成RIPK1-RIPK3-WLKL 復(fù)合物,然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜并促使細(xì)胞破裂,驅(qū)動壞死性凋亡的執(zhí)行[17]。有證據(jù)[18]表明,心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)損傷后過量產(chǎn)生的氧自由基可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞壞死性凋亡；另一方面,壞死性凋亡又會促進(jìn)氧自由基產(chǎn)生、加重細(xì)胞損傷[18]。本課題組既往研究[16]發(fā)現(xiàn),高糖刺激上調(diào)心肌細(xì)胞RIPK3 表達(dá),促進(jìn)壞死性凋亡。本研究發(fā)現(xiàn),DHY 降低DCW 小鼠心肌中RIPK3 表達(dá),提示DHY抑制DW 心肌壞死性凋亡,這可能與DHY 減輕氧化應(yīng)激密不可分,同時也會進(jìn)一步減弱氧化損傷,形成良性循環(huán),從而改善心功能。

綜上所述,DHY 增加DW 小鼠心肌組織中SIRT3 表達(dá),抑制氧化應(yīng)激,減弱壞死性凋亡,增強(qiáng)心臟收縮和舒張功能,改善DCW,為DCW 防治提供了新思路,具有潛在的轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。