王小瑜，高書美，周 巧，金 會，惠美琦，嚴(yán)美娟*，沈洪妹*

（南通大學(xué) 教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001）

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）來自革蘭陰性菌細(xì)胞壁的一種非蛋白內(nèi)毒素[1],是Toll 樣受體4（Toll like receptor，TLR4）代表性配體,能引起免疫細(xì)胞激活,特別是小膠質(zhì)細(xì)胞激活[2],促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá),釋放腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等促炎因子[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐和原發(fā)性免疫細(xì)胞,在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮重要作用[4-5]。研究[6-7]表明,神經(jīng)炎癥成為神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病、多發(fā)性硬化等疾病的致病因素,成為這些疾病的治療靶向。但至今缺乏確實(shí)證據(jù)表明糖基化調(diào)控神經(jīng)炎癥。

糖基化是翻譯后的一種重要修飾,決定蛋白質(zhì)功能,在炎癥、細(xì)胞黏附和內(nèi)吞等重要過程中起著關(guān)鍵作用[8-9]。β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（β-1，4-galactosyltransferases，β-1，4-GalTs）家族由7 名成員組成（β-1，4-GalT Ⅰ～Ⅶ）[10],其中β-1，4-GalT Ⅴ是一種單鏈Ⅱ型跨膜蛋白,主要位于高爾基體,通過形成催化蛋白,參與蛋白糖基化修飾,調(diào)控β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶N-?；拾贝迹é?1，4-galactosyltransferase N-acylsphingosine，GlcNAc）鏈[11]。N.NAKAWURA 等[12]通過小鼠腦cDNA 克隆β-1，4-GalT Ⅴ,并發(fā)現(xiàn)其在產(chǎn)后表達(dá)增加。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)[13]結(jié)果表明,β-1，4-GalT Ⅴ在腦組織中表達(dá),參與創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）鼠的空間學(xué)習(xí)記憶恢復(fù)。因此,本研究將以LPS 刺激構(gòu)建神經(jīng)炎癥模型,通過注射β-1，4-GalT Ⅴ干擾和過表達(dá)病毒顆粒,觀察β-1，4-GalTⅤ對iNOS、腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）表達(dá)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 病毒構(gòu)建 β-1，4-GalT Ⅴ-RNA 干擾序列（TTCGGGACAACGTGAGGACCA）和對照序列（TTCTCCGAACGTGTCACGT）插入hU6-WCS-Ubiquitin-EGFPIRES-puromycin 質(zhì) 粒Age1/EcoR1 位 點(diǎn),β-1，4-GalT ⅤcDNA 和對照序列插入U(xiǎn)bi-WCS-3FLAGCBh-gcGFP-IRES-puromycin 質(zhì)粒BamH1/Age1 位點(diǎn)。慢病毒顆粒采用HEK-293T 細(xì)胞包裝,并進(jìn)行效價測定,由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.2 病毒顆粒注射與LPS 模型構(gòu)建 清潔級成年Sprague Dawley（SD）雄性大鼠（200～250 g）,腹腔注射10%水合氯醛（0.2～0.3 mL/100 g）進(jìn)行麻醉。在大腦皮質(zhì)上方進(jìn)行雙側(cè)開顱手術(shù),注射口位于前囟后方3.0 mm,矢狀縫左右兩側(cè)3.0 mm,病毒注射深度為3.0 mm,注射速度為0.2 μL/min,注射時間5 min,共注射1 μL 慢病毒。病毒注射采用KOPF 腦立體定位儀Wodel 900、WPI 納升顯微注射泵Nanoliter 2010顯微注射儀Wicro 4 進(jìn)行。注射慢病毒3 d 后,腹腔注射LPS（0.5 mg/kg）建立LPS 動物模型。手術(shù)方案經(jīng)南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（20180307-004）,操作遵循中國實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理和使用指南。

1.3 組織免疫熒光染色 腹腔注射LPS 6 h 后,以10%水合氯醛0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉,剪開皮膚、胸腔,暴露心臟,生理鹽水灌注后,進(jìn)行4%多聚甲醛灌注。灌注后取腦組織,于4 %多聚甲醛中進(jìn)行后固定24 h 后,于10%、20%、30%的蔗糖溶液中梯度脫水,組織沉淀后,進(jìn)行冰凍切片,切片厚度為12 μm。室溫下,切片用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗,封閉液37 ℃孵育1 h,一抗（鼠抗iNOS,1∶500；兔抗β-1，4-GalT Ⅴ,1∶500；Abcam 公司）于4 ℃孵育過夜,PBS 洗滌,熒光抗兔和鼠二抗室溫孵育2 h。采用DWR 倒置Leica 顯微鏡采集圖像。

1.4 免疫印跡 取100 mg 病毒注射部位組織置于5 mL 離心管中,加入300 μL 裂解液,超聲波粉碎機(jī)粉碎組織,冰上裂解30 min,12 000 r/min,4 ℃離心20 min,收集上清。BCA 法檢測上清蛋白濃度,并將蛋白濃度調(diào)整一致。按常規(guī)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后,加入5%含吐溫的Tris 鹽酸緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）-BSA 中37 ℃封 閉2 h。加入一抗（兔抗TNFR1/TNFR2,1∶1 000,Proteintech 公司）4 ℃孵育過夜,TBST 洗膜后,辣根過氧化物酶連接的抗兔IgG（1∶1 000）孵育2 h,并使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）顯影液顯像,以β-actin 為內(nèi)參。

1.5 RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測 采用RNA 快速純化試劑盒（ES Science 公司）,提取分離腦組織總RNA；采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公司）通過寡核苷酸（dT18）合成第一鏈cDNA。Light Cycler 96 和SYBR Green PCR Waster Wix（Roch 公司）進(jìn)行RT-PCR 檢測iNOS 基因表達(dá)水平。引物（iNOS:5′-AACCCAAGGTCTACGTTCAAG-3′,5′-AAAGTGGTAGCCATCCCG-3′；β-actin:5′-CAGTTCGCCATGGATGACGATATC-3′,5′-CACGCTCGGTCAGGATCTTCATG-3′）購于Thermo Fisher Scientific 公司,β-actin 作為內(nèi)部對照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均至少進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),采用單因素方差分析和t 檢驗(yàn),P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,利用GraphPad Prism、Adobe Photoshop以及Image J 作為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖軟件。

2 結(jié) 果

2.1 β-1，4-GalT Ⅴ對LPS 誘導(dǎo)后iNOS 表達(dá)的影響 采用組織免疫熒光染色,在LPS 腹腔注射動物皮層細(xì)胞胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)β-1，4-GalT Ⅴ與iNOS 存在共定位（圖1A）。采用RT-PCR 檢測皮層中iNOS 表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS 腹腔注射能明顯增加皮層中iNOS的mRNA 水平,β-1，4-GalT Ⅴ敲減消除了LPS 刺激引起iNOS mRNA 水平增加,β-1，4-GalT Ⅴ表達(dá)增加卻能加劇LPS 對iNOS mRNA 表達(dá)的影響（圖1B）。

圖1 β-1，4-GalT Ⅴ對LPS 誘導(dǎo)后iNOS 表達(dá)的影響

2.2 β-1，4-GalT Ⅴ對LPS 誘導(dǎo)后TNFR1 和TNFR2 表達(dá)的影響 采用免疫印跡,發(fā)現(xiàn)LPS 腹腔注射使腦組織中TNFR1 蛋白表達(dá)特異性增加,而β-1，4-GalT Ⅴ敲減能消除LPS 誘導(dǎo)的TNFR1 水平增加（圖2A～B）。但是,無論是LPS 刺激還是β-1，4-GalTⅤ表達(dá)變化,都不能改變腦組織中TNFR2 蛋白表達(dá)（圖2A、C）。

圖2 β-1，4-GalT Ⅴ對LPS 誘導(dǎo)后TNFR1 和TNFR2 表達(dá)的影響

3 討 論

β-1，4-GalT Ⅴ在腦組織表達(dá),參與TBI 功能恢復(fù)[13]。研究[6-7]表明,神經(jīng)炎癥在TBI 中發(fā)揮重要作用,但β-1，4-GalT Ⅴ是否通過神經(jīng)炎癥實(shí)現(xiàn)其在TBI 的作用,至今沒有實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。本研究以腹腔注射LPS 建立炎癥模型,發(fā)現(xiàn)β-1，4-GalT Ⅴ與iNOS 共定位,參與LPS 刺激引起的iNOS 及TNFR1 表達(dá)增強(qiáng)。

LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的一種成分,通過TLR4 識別,激活免疫細(xì)胞,導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)表達(dá)增加,包括iNOS,以及促炎細(xì)胞因子,如TNF-α[14-16]。TNF-α 是一多效性細(xì)胞因子,通過兩種不同的TNF特異性質(zhì)膜定位受體,1 型TNF 受體（TNFR1,CD120 a）和2 型TNF 受體（TNFR2,CD120b）,參與多種病理生理過程,發(fā)揮多種生物學(xué)功能[17-18]。腹腔注射LPS,引起iNOS 表達(dá)增加,促進(jìn)NO 的釋放[19-20],TNFR1 表達(dá)特異性增加,但TNFR2 不受影響。因此,LPS 腹腔注射引起神經(jīng)炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為皮層組織中iNOS 和TNFR1 表達(dá)增加。

β-1，4-GalT Ⅴ是一類重要的糖基轉(zhuǎn)移酶,通過將UDP-半乳糖苷中的半乳糖苷基團(tuán)轉(zhuǎn)移到N-乙酰氨基葡萄糖中,形成半乳糖苷酶來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的糖基化β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶N-酰基鞘氨醇（Gal β-1，4-GlcNAc）組[21]。組織免疫熒光染色結(jié)果表明,β-1，4-GalT Ⅴ在皮層組織表達(dá),這和以往實(shí)驗(yàn)[13]發(fā)現(xiàn)Gal β-1，4-GlcNAc 組在皮層中表達(dá)相一致。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),β-1，4-GalT Ⅴ和iNOS 存在共定位,敲減β-1，4-GalT Ⅴ使LPS 刺激引起的iNOS 表達(dá)增加消失,并特異性抑制LPS 刺激引起的TNFR1表達(dá)水平增加。因此,本研究提示β-1，4-GalT Ⅴ參與LPS 引起的神經(jīng)炎癥,影響LPS 模型中iNOS 及TNFR1 表達(dá),但其影響的確切機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。