姜 威, 張淑梅, 閆更軒, 田 緣, 胡基華, 潘 鈺, 夏海華, 吳皓瓊, 于 沖*

(1.黑龍江省科學院 微生物研究所, 黑龍江 哈爾濱 150010;2.黑龍江省科學院 高技術研究院, 黑龍江 哈爾濱 150020)

長期施用化肥農藥所導致的環(huán)境污染是我國綠色農業(yè)發(fā)展面臨的挑戰(zhàn)和急需解決的重要問題，研發(fā)新型微生物農藥，是實現(xiàn)化肥農藥雙減、土壤修復、生態(tài)和食品安全以及農業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的一個重要途徑[1]。目前，活體微生物農藥存在見效慢、應用效果不穩(wěn)定和菌株退化等瓶頸問題，微生物代謝產物-抗生素農藥存在抗藥性問題[2]。因此，尋找新資源和新結構微生物代謝產物是微生物農藥研發(fā)新方向。芽胞桿菌能夠產生小肽、蛋白、脂肽、細菌素、酚類及多烯類等多種抗菌物質[3-4]，是微生物代謝產物農藥研發(fā)的重要資源菌，充分挖掘抗菌物質基因可以為植物抗病育種和菌株定向遺傳改造提供基因資源。挖掘功能基因常規(guī)方法是由物質到基因，即先對功能物質進行分離純化、鑒定，再克隆全基因進行測序。組學技術的發(fā)展為尋找活性代謝產物基因提供了新方法。呂偉強等[5]通過對銀杏葉內生菌KW-1-2的全基因組序列ORFs信號肽和分泌蛋白組合法預測分析，發(fā)現(xiàn)271個具有典型信號肽的分泌蛋白；楊曉玫等[6]通過對B.mycoidesGnyt1進行全基因組測序，挖掘到促生功能相關的基因——鐵載體分泌相關功能基因；戚家明等[7]通過對生防菌株PF-1基因組測序，發(fā)現(xiàn)15種具有抗菌活性次級代謝產物基因簇；廖開吉等[8]利用amtiSMASH對菌株FP1761次生代謝基因簇進行預測，發(fā)現(xiàn)兩個與嗜鐵素pyoverdine合成相關的基因簇。貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新型生防微生物，具有防病促生作用，受到國內外研究者的廣泛關注[9-10]。貝萊斯芽胞桿菌HG18是1株低溫生防菌，抑菌譜廣，能夠分泌抗菌蛋白、脂肽、IAA等多種抗病促生物質，具有很好的開發(fā)應用潛力。本研究采用二、三代結合測序技術對其進行基因組測序，挖掘抗菌相關功能基因，解析基因系統(tǒng)進化性，為后續(xù)基因的克隆表達及功能驗證、植物抗病育種以及提高原始菌株抗菌物質產量的定向改造提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株BacillusvelezensisHG18是一株具有防病促生功能的生防菌，保存于黑龍江省科學院微生物研究所菌保中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.2，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 主要試劑與儀器 基因組提取試劑盒(N2703，天根生化科技公司)；DNA回收純化試劑盒(M2230，天根生化科技公司)；瓊脂糖。超凈工作臺(ZHJH-C1115C，上海智城公司)；恒溫振蕩培養(yǎng)器(ZHWY-211B，上海智城公司)；臺式離心機(3K15，上海智城公司)；恒溫培養(yǎng)箱(BPH-9082，上海一恒公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因組測序 由深圳華大基因公司完成測序，采用基于DNBSEQ二代測序平臺和Nanopore三代測序平臺相結合方法，分別構建測序文庫，進行denovo測序。二代測序插入庫大小為270～300 bp，三代測序插入庫大小為20 kb。

1.2.2 序列數(shù)據(jù)處理 分別采用SOAPnuke 1.5.6和Porechop 0.2.4軟件對二代和三代測序數(shù)據(jù)進行質量控制，Kmer軟件校正，校正后的序列使用Unicycler v 0.4.7軟件拼裝。

1.2.3 基因組信息注釋 采用Glimmer 3.02軟件進行組裝結果的基因預測，RNAmmer 1.2、tRNAscan 1.3.1和Infernal軟件進行非編碼RNA分析，通過Tandem Repeats Finder 4.04軟件預測串聯(lián)重復序列，并根據(jù)重復單元長度及數(shù)目篩選出其中的微衛(wèi)星以及小衛(wèi)星序列?；贕O、KEGG、Swiss-Prot、COG、NR、CAZY等數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋。

2 結果與分析

2.1 序列信息統(tǒng)計

二代測序獲得高質量Reads 6 952 326條，高質量Reads堿基數(shù)為1 042 Mb，占比97.08%。三代測序序列長，過濾后的Reads 數(shù)為3 640 380條，堿基數(shù)為1 600 003 363 bp，最長Reads 91 343 bp，最短Reads 2 000 bp，平均Reads長度4 395 bp。二、三代測序數(shù)據(jù)質量高，保證了后續(xù)分析的準確性。

2.2 基因組組裝與基因組信息

組裝測序數(shù)據(jù)，進行單堿基糾正、序列環(huán)狀、質粒庫比對等分析，組裝成一個環(huán)狀染色體和一個環(huán)狀質粒。染色體堿基數(shù)4 239 316 bp，GC含量43.58%；質粒堿基數(shù)222 528 bp，GC含量37.25%?；蚪M大小4 461 844 bp,編碼4 643個基因，含有87個串聯(lián)重復序列，57個小衛(wèi)星DNA，6個微衛(wèi)星DNA，86個tRNA,25個sRNA,10個5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，2個CRISPR和9個Prophage，23個基因島。編碼基因總長度3 893 994 bp，占基因組87.27%，GC含量44.06%，結果見表1。

表1 基因組信息

2.3 基因注釋

將基因在VFDB、ARDB、TREMBL、CAZY、IPR、SWISSPROT、COG、GO、KEGG、NR和T3SS數(shù)據(jù)庫中進行比對和注釋，結果見表2。VFDB數(shù)據(jù)庫預測了204個致病菌毒力因子，其中22個與蛋白水解和轉錄調控相關；ARDB數(shù)據(jù)庫預測了31個與氯霉素、萬古霉素、鏈霉素、桿菌肽相關的抗性基因；CAZY注釋顯示有63個糖苷水解酶GHs，15個糖類酯解酶CEs，36個糖基轉移酶GTs，7個多糖裂解酶PLs，2個輔助功能AAs，40個碳水化合物相關酶CBMs；TREMBL數(shù)據(jù)庫中注釋的4 401個基因中有980個功能未知；COG功能注釋中有228個基因功能未知(圖1A)；GO功能注釋了2 588個基因，歸屬于細胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物過程(biological process)3個部分(圖1B)；KEGG分析顯示，62.70%基因參與碳水化合物、氨基酸、次級代謝產物、脂、糖原、能量、萜類、聚酮類、核苷酸和外源物質降解代謝(圖1C)。

表2 基因注釋結果

圖1 菌株HG18基因組COG(A)、GO(B)和KEGG(C)分類

2.4 抗菌功能基因挖掘

基因功能分析發(fā)現(xiàn)6個與幾丁質降解的相關基因，其中GL000617、GL001507和GL003599編碼糖苷水解酶18家族蛋白，能夠水解幾丁質中的β-1,4糖苷鍵；GL000017和GL002074編碼幾丁質裂解酶；GL003784編碼β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，可協(xié)同幾丁質內切酶或幾丁二糖外切酶水解幾丁質。KEGG分析沒有發(fā)現(xiàn)這些基因參與的具體代謝途徑，GO功能分析顯示這些基因參與碳水化合物代謝過程，發(fā)揮幾丁質結合功能。系統(tǒng)進化分析顯示這些基因與Bacillushalotolerans和Bacillussubtilis同源性較高，GL000017與B.halotoleransF41-3和B.halotoleransXH-1的肽聚糖結合蛋白基因同源性為100%，與B.halotoleransZB201702和B.subtilisKKD1同源性為99%。GL002074與B.halotoleransF41-3和B.halotoleransZB201702的幾丁質結合蛋白基因同源性為100%，與B.halotoleransXH-1幾丁質結合蛋白基因及B.subtilisKKD1裂解多糖單加氧酶基因同源性為99%。GL000617、GL001507和GL003599與上述4株菌的糖苷水解酶18家族基因同源性高，為99%～100%；GL003784與上述4株菌的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因同源性較高，為99%。2個葡聚糖酶基因(GL001922和GL001988)和1個殼聚糖酶GL001299也與上述4株菌株的同源性較高。另外，發(fā)現(xiàn)1個編碼抗菌物質subtilisin的基因GL001102，系統(tǒng)進化分析其與B.subtilisKKD1和B.halotoleransF41-3同源性較高，為99%；1個編碼抗菌物質bacillolysin基因GL001608，系統(tǒng)進化分析與B.halotoleransZB201702和B.halotoleransP1同源性較高，為99%。還發(fā)現(xiàn)脂肽類抗菌物質芬芥素與表面活性素合成基因簇，芬芥素合成基因簇含有5個基因(FenB、FenA、FenE、FenD、FenC)，全長37 518 bp，表面活性素合成基因簇含有4個基因(srfAA、srfAB、srfAC、srfATE)，全長26 076 bp。結果見表3、圖2。

表3 抗菌功能基因注釋

圖2 部分抗菌功能基因系統(tǒng)進化樹

3 討 論

貝萊斯芽胞桿菌HG18是一株能產生多種抗菌促生物質的生防菌株，本研究對該菌株進行全基因組測序，從分子水平挖掘抗菌功能基因，為后續(xù)基因的克隆表達及功能驗證、植物抗病育種以及提高菌株抗菌物質產量的定向改造提供參考。

幾丁質、葡聚糖、殼聚糖是植物病原真菌細胞壁的主要成分，生防菌株能夠產生幾丁質、葡聚糖與殼聚糖降解酶，降解真菌細胞壁使其失去生長繁殖能力。幾丁質酶是降解幾丁質的主要酶，具有多樣性，不同微生物可以產生不同種類的幾丁質酶[11]。幾丁質酶能夠破壞真菌菌絲生長，抑制真菌孢子萌發(fā)、芽管伸長，使芽管和附著胞解體，在真菌的生防過程中具有重要作用[12]。菌株HG18基因組中發(fā)現(xiàn)6個與幾丁質降解相關基因(GL000617、GL001507、GL003599、GL000017、GL002074和 GL003784)，GO和KEGG分析顯示具有降解幾丁質功能，但基因序列與幾丁質酶基因差異較大，推測這些基因可能編碼一些具有幾丁質酶功能的未知蛋白，后續(xù)將對這些基因進行功能驗證。殼聚糖酶和葡聚糖酶具有抑制病原真菌生長作用，Tomita[13]和Gao等[14]研究表明B.circulasmh-k1和B.cereusD-11產生的殼聚糖酶能夠抑制病原真菌生長，將mh-k1中的殼聚糖酶基因轉到水稻中，增強了水稻對稻瘟病的抵抗能力[15]。國惠[16]研究發(fā)現(xiàn)生防萎縮芽胞桿菌β-1,3-葡聚糖酶具有抑菌功能；李文鵬[17]從芽胞桿菌Bacillussp.HT-7中分離出葡聚糖酶，能夠防治棉花黃萎病。孫平平等[18]通過對貝萊斯芽胞桿菌L-1全基因組分析發(fā)現(xiàn)，菌株L-1中含有合成fengycin、surfactin、bacillaene、bacillibactin等多種聚酮糖類和肽聚糖抗性化合物的基因簇，以及能夠降解病原菌細胞壁的幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶相關的基因。本研究基于菌株HG18全基因組數(shù)據(jù)，挖掘到6個幾丁質降解相關基因，2個葡聚糖酶基因和1個殼聚糖酶基因，這些基因均與B.halotoleransXH-1、B.halotoleransZB201702、B.halotoleransF41-3和B.subtilisKKD1 同源性較高，這些基因的挖掘為前期研究發(fā)現(xiàn)的菌株抑制多種病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)提供了參考。

芽胞桿菌能夠分泌細菌素和脂肽類抗生素，細菌素subtilin和bacillolysin可以抑制病原細菌生長，脂肽類抗生素表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和芬芥素(Fengycin)能夠抑制植物病原真菌。菌株HG18基因組中含有細菌素subtilin和bacillolysin編碼基因，推測菌株具有抵抗病原細菌能力。另外，發(fā)現(xiàn)Surfactin和Fengycin合成基因簇，Surfactin基因簇大小與B.amylo-liquefaciensTF28相當，比B.amyloliquefaciensFZB42T小，F(xiàn)engycin基因簇小于B.amyloliquefaciensTF28，沒有發(fā)現(xiàn)Iturin合成基因簇，推測菌株具有分泌Surfactin和Fengycin的基因基礎。本研究基于基因組數(shù)據(jù)有限信息預測抗菌功能相關基因，對于這些基因的功能還需進行下一步的驗證。