孫 杰, 沈 敏, 吳恬菲，倫永志1,*

(1.莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100；2.莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，福建 莆田 351100)

益生菌只有達(dá)到一定的攝入量時，才能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生益生作用，不同種類的益生菌具有相似或特有的生理特性[1]。乳桿菌作為益生菌的主要類別，具有無毒、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑菌、抗癌等優(yōu)良特性，常作為微生態(tài)制劑的生產(chǎn)菌種而被廣泛開發(fā)及應(yīng)用[2]，其作為抗生素替代品能夠抑制細(xì)菌生長，同時降低細(xì)菌耐藥性，提高機(jī)體免疫力，其中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)耐受性較強(qiáng)，某些特定的植物乳桿菌還能夠預(yù)防和抵抗疾病發(fā)生[3]。植物乳桿菌PUM1785更有別于一般來自健康人體或植物的植物乳桿菌，其分離自長期接受抗生素或激素治療患者的糞便[4]。此類患者免疫力較低，且由于長期服用抗生素或激素，導(dǎo)致益生菌難以在腸道中定植[5]，因此較難從上述患者的腸道微生態(tài)環(huán)境中分離得到益生菌。若益生菌不能定植則其益生作用便無法發(fā)揮，而能否穩(wěn)定定植的關(guān)鍵取決于益生菌是否具有強(qiáng)耐受性和黏附能力，這表明植物乳桿菌PUM1785可能具備足夠強(qiáng)的耐受性和抗性。隨著高通量檢測技術(shù)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，對益生菌研究也上升到了基因組學(xué)層次。通過對植物乳桿菌PUM1785進(jìn)行基因組測序，全面分析該菌株的基因組功能，從而預(yù)測和發(fā)現(xiàn)其潛在的益生作用，為其成為微生態(tài)制劑或功能性食品的生產(chǎn)菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)PUM1785由莆田學(xué)院醫(yī)學(xué)微生態(tài)學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS肉湯培養(yǎng)基購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 超低溫冰箱(Forma-990，美國Thermo Fisher Scientific公司)；手提式壓力蒸汽滅菌器(DSX-280B，上海申安醫(yī)療器械廠)；生物安全柜(HFsafe-1200LC，上海力申科學(xué)儀器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DRP-9082，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；全溫培養(yǎng)搖床(QYC-200，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；醫(yī)用離心機(jī)(L420，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與培養(yǎng) 將瓷珠法保存的菌種接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接種至MRS平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，分離出單個菌落，再轉(zhuǎn)接至MRS肉湯培養(yǎng)基于30 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，收集菌體。

1.2.2 細(xì)菌基因組提取與測序 按細(xì)菌DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit)說明書提取細(xì)菌基因組，進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在濃度和純度達(dá)到測序要求后，構(gòu)建DNA文庫。將DNA樣品隨機(jī)打斷成長度約為350 bp或6 kb的片段，后者再進(jìn)行環(huán)化擴(kuò)增，產(chǎn)物隨機(jī)打斷為350 bp左右的片段，并用探針捕獲環(huán)化引物兩側(cè)的序列。處理后的DNA片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成DNA文庫制備，插入片段檢測符合預(yù)期后，準(zhǔn)確定量文庫的有效濃度，以保證文庫質(zhì)量。隨后利用Illumina HiSeq高通量測序平臺完成全基因組測序。

1.2.3 基因組裝 測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)經(jīng)過濾處理后得到Clean Data，利用SOAP denovo 2.04[6]、SPAdes[7]和ABySS 2.0[8]軟件進(jìn)行組裝，并利用CISA軟件進(jìn)行整合；利用GapClose 1.12[6]軟件對初步組裝結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化和補(bǔ)洞，從而得到最終的組裝結(jié)果。

1.2.4 序列分析 利用GeneMarkS[9]軟件對植物乳桿菌PUM1785全基因組測序結(jié)果進(jìn)行編碼基因預(yù)測。基于獲得的氨基酸序列，利用Diamond[10]軟件與非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-Redundant Protein Database，NR)、京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(Carbohydrate-Active EnZymes Database，CAZy)、直系同源基因數(shù)據(jù)庫(Cluster of Orthologous Groups of proteins，COG)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫(Transporter Classification Database，TCDB)、毒力因子數(shù)據(jù)庫(Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB)、抗生素抗性基因數(shù)據(jù)庫(Antibiotic Resistance Genes Database，ARDB)進(jìn)行比對分析；利用IPRscan[11]軟件與基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene Ontology，GO)進(jìn)行比對分析；利用Resistance Gene Identifier[12]軟件與綜合抗生素研究數(shù)據(jù)庫(Comprehensive Antibiotic Research Database，CARD)進(jìn)行比對分析，逐一得到基因功能注釋結(jié)果。利用antiSMASH-4.0.2[13]軟件預(yù)測全基因組中的已知次級代謝產(chǎn)物合成基因簇。從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫下載20株植物乳桿菌參考基因組序列(表1)，與PUM1785株基因組序列進(jìn)行分子進(jìn)化比較分析。利用在線工具M(jìn)USCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle)進(jìn)行直系同源比對，利用MEGA X[14]軟件構(gòu)建全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹(自展一致樹)。

表1 植物乳桿菌參考基因組信息

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組概況

植物乳桿菌PUM1785與模式菌株WCSF1基因組特征高度相似。前者基因組大小3 128 032 bp，GC含量44.56%，共計(jì)注釋得到2 995個編碼基因，其序列長度達(dá)到2 642 256 bp，占全基因組總長84.47%；后者基因組大小3 308 273 bp；GC含量44.5%，共計(jì)注釋得到3 042個編碼基因[15]。

2.2 功能注釋

2.2.1 NR注釋 NR注釋結(jié)果表明，物種分類高度集中于植物乳桿菌類別中，從而確定了植物乳桿菌PUM1785的分類歸屬。

2.2.2 GO注釋 共有2 014個基因在GO數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋(圖1)。在分子功能中，基因數(shù)量位列榜首的注釋功能為催化，其次是結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)；與細(xì)胞組分有關(guān)的基因集中注釋于細(xì)胞、細(xì)胞組分和細(xì)胞器；在生物過程乃至整個GO注釋結(jié)果中，基因注釋量最高的是新陳代謝，達(dá)到1 140，細(xì)胞過程的基因注釋量為1 139，與定位有關(guān)的基因注釋量共計(jì)816。細(xì)胞組分注釋結(jié)果表明，植物乳桿菌PUM1785具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，生物膜能夠保護(hù)菌體抵抗外界環(huán)境。定位和建立定位的基因主要參與細(xì)菌黏附，有利于該菌株定殖在宿主細(xì)胞表面，并降低病原菌對宿主細(xì)胞的侵襲[16]。

圖1 植物乳桿菌PUM1785 GO數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果

2.2.3 KEGG注釋 共有2 870個基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中得到功能注釋，其中1 299個基因被注釋到各個代謝通路(圖2)，主要分布于代謝通路和環(huán)境信息處理通路中。代謝通路中基因數(shù)量最多的是碳水化合物代謝，氨基酸代謝次之。而環(huán)境信息處理中得到最多注釋的是膜運(yùn)輸。碳水化合物代謝通路包括各種糖類的代謝通路，高達(dá)206個基因的注釋量意味著植物乳桿菌PUM1785具有較強(qiáng)的糖類分解和代謝功能。膜運(yùn)輸通路主要集中于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)以及細(xì)菌分泌系統(tǒng)，表明該菌株具有較強(qiáng)的適應(yīng)外界環(huán)境的能力。

圖2 植物乳桿菌PUM1785 KEGG數(shù)據(jù)庫通路注釋結(jié)果

2.2.4 COG注釋 COG注釋結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄功能得到最多基因注釋量(圖3)，達(dá)到262個。糖類物質(zhì)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)功能蛋白也得到了較高的基因注釋量，意味著該菌株具有較強(qiáng)的碳水化合物代謝能力。該菌株還在細(xì)胞壁、生物膜和包膜生物發(fā)生中獲得141個基因注釋量，可以輔證該菌株具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，并在防御機(jī)制中得到69個基因注釋量，提示該菌株能夠抵抗消化道環(huán)境，為穩(wěn)定定殖于腸道上皮細(xì)胞提供必要條件。

圖3 植物乳桿菌PUM1785COG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果

2.2.5 TCDB注釋 在TCDB注釋結(jié)果中，以主動轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、電化學(xué)勢驅(qū)動轉(zhuǎn)運(yùn)子為主(圖4)。根據(jù)結(jié)合膜運(yùn)輸通路基因的高注釋結(jié)果，可以推測植物乳桿菌PUM1785的運(yùn)輸方式以主動轉(zhuǎn)運(yùn)為主、離子通道運(yùn)輸為輔。

圖4 植物乳桿菌PUM1785 TCDB數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果

2.2.6 CAZy注釋 在CAZy注釋結(jié)果中(圖5)，得到最高注釋量的是糖苷水解酶，其次是糖基轉(zhuǎn)移酶。糖苷水解酶作用于含有2個及以上1, 4-α-D-葡萄糖基的多糖中的1, 4-α-D-葡萄糖苷鍵，參與糖代謝通路中的多糖水解過程。糖代謝過程中釋放的大量能量，為菌體活動提供充足能量。糖基轉(zhuǎn)移酶催化糖基與非糖物質(zhì)或者其他糖類物質(zhì)的基團(tuán)進(jìn)行轉(zhuǎn)移或交換。單糖通過糖苷鍵聚合起來形成聚糖，聚糖再與蛋白質(zhì)共價結(jié)合生成蛋白聚糖或糖蛋白，從而參與各種生理過程[17]。

圖5 植物乳桿菌PUM1785CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果

2.3 分子進(jìn)化分析

用于比較分析的植物乳桿菌基因組均為單一拷貝，經(jīng)多序列比對后構(gòu)建全基因組進(jìn)化樹(圖6)。結(jié)果表明，植物乳桿菌PUM1785在進(jìn)化上與CGMCC 1.557株的親緣關(guān)系最近，尤其與植物乳桿菌模式菌株WCSF1株親緣關(guān)系相當(dāng)近[18]，而與ST-III株和CAUH2株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖6 植物乳桿菌PUM1785全基因組系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 次級代謝合成產(chǎn)物基因簇分析

植物乳桿菌PUM1785基因組具有1個細(xì)菌素類基因簇，共計(jì)15個基因，與其他乳桿菌同源基因簇的比對結(jié)果見圖7A。相似度≥50%的細(xì)菌共有10個，其中日本清酒乳桿菌I151sakacinP基因簇、日本清酒乳桿菌spiA-sppA-sppE-sppK-sppR-sppT基因簇、鼠李糖乳桿菌Lc705基因簇一致性為66%。日本清酒乳桿菌I151sakacin P由spp基因簇編碼，具有抑制單核李斯特菌的功能[19]。spiA為免疫基因，sppA為結(jié)構(gòu)基因，sppE和sppT負(fù)責(zé)細(xì)菌素sakacin P的轉(zhuǎn)運(yùn)，sppK包含突變和/或插入元件[20]。鼠李糖乳桿菌Lc705能夠下調(diào)β-葡萄糖醛酸酶和脲酶活性，從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)生[21]。具有50%一致性的細(xì)菌分別為日本清酒乳桿菌sakacinA基因簇[22]、干酪乳桿菌LOCK919基因簇[23]、鼠李糖乳桿菌CBZU00000000序列[24]、鼠李糖乳桿菌ATCC8530基因簇[25]，均具有抑菌活性。此外，干酪乳桿菌張氏株能夠預(yù)防和抵抗結(jié)腸癌發(fā)生[26]。綜合細(xì)菌素基因簇序列對比結(jié)果，可以預(yù)見植物乳桿菌PUM1785具有以上類似功能。

植物乳桿菌PUM1785具有1個萜類基因簇，共24個基因，與其他乳桿菌同源基因簇的比對結(jié)果見圖7B。萜類物質(zhì)為異戊二烯整數(shù)倍的烯烴類化合物，具有獨(dú)特芳香。由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠在抑菌、抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、治療糖尿病及神經(jīng)保護(hù)等方面發(fā)揮作用[27-28]，故作為新藥開發(fā)的重要來源而得到重視。

圖7 植物乳桿菌PUM1785次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的序列比較

2.5 致病性分析

2.5.1 毒力因子注釋 在VFDB注釋結(jié)果中，得到107個基因注釋量，主要涉及細(xì)菌黏附與定殖、細(xì)菌逃避宿主免疫防御系統(tǒng)和細(xì)菌毒素(表2)。一般來說，細(xì)菌進(jìn)入宿主體內(nèi)后會被吞噬細(xì)胞捕捉并消滅，但具有逃逸宿主免疫防御系統(tǒng)的毒力因子能夠幫助細(xì)菌免于清除。細(xì)菌的黏附功能與其特殊結(jié)構(gòu)及某些蛋白有關(guān)。植物乳桿菌PUM1785的一部分毒力因子能夠介導(dǎo)侵襲過程，如抑制補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬作用、激發(fā)炎癥、使細(xì)菌黏附到宿主靶細(xì)胞；還包括溶血素和細(xì)胞溶素，能夠刺激IL-1β和TNF的釋放，并溶解多種革蘭陽性菌。此類毒力因子數(shù)量極少，因此可以忽略其致病性。

表2 細(xì)菌黏附素和細(xì)菌毒素的類型、數(shù)量及作用機(jī)制

2.5.2 耐藥基因注釋 ARDB結(jié)果中僅注釋到十一碳二烯基焦磷酸磷酸酶，表現(xiàn)為桿菌肽耐藥。CARD得到18個注釋結(jié)果(表3)，共包括14種抗生素抗性基因，包括林可霉素、喹諾酮類抗生素、磷霉素、伊霉素、利福平、多肽類抗生素、莫匹羅星等。雖然林可霉素和喹諾酮類的抗性蛋白注釋量較高，但并不意味植物乳桿菌PUM1785一定表達(dá)該抗性。細(xì)菌可以通過外排抗性蛋白從而達(dá)到保護(hù)自身的目的，如細(xì)菌外排絲氨酸蛋白酶抑制劑使得自身能夠免受腸道膽汁鹽水解及其他外在環(huán)境的影響，有利于在腸道中生存[37]。已有研究表明，植物乳桿菌WCSF1株對人體消化道環(huán)境有很強(qiáng)的耐受性[38]，在相同給藥濃度和方式下，WCSF1株有更高的腸道存活率[39]。值得注意的是，由于PUM1785株與WCSF1株進(jìn)化距離很近，這意味著PUM1785株具有同樣的腸道耐受性。外排泵賦予細(xì)菌抗生素耐藥性，通過抑制外分泌過程阻斷耐藥蛋白分泌到細(xì)菌體外，從而解除耐藥蛋白對抗生素的抑制功能，使菌株不再對該抗生素產(chǎn)生耐藥[40]。

表3 抗生素耐藥基因的頻率和種類

3 討 論

植物乳桿菌PUM1785分離自潛在多重耐藥腫瘤患者腸道，若能證明其同時具有高耐受性和益生功能，且對宿主無致病性，則有望成為后續(xù)的微生態(tài)制劑或功能性食品開發(fā)的生產(chǎn)菌株。本研究從基因組層面對該菌株的基因功能進(jìn)行了全面分析：①該菌株具有較強(qiáng)的生物膜形成能力和識別宿主細(xì)胞的能力，而生物膜能夠幫助細(xì)菌抵抗外界不利的因素；②該菌株含有與碳水化合物代謝過程相關(guān)的酶類和所需的蛋白，能夠充分利用碳水化合物，并在腸道內(nèi)具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)及生存能力；③當(dāng)該菌株進(jìn)入腸道后，通過對宿主細(xì)胞識別能力的調(diào)控和表達(dá)莢膜、鞭毛、纖連蛋白結(jié)合蛋白等黏附因子，使菌株能夠牢固黏附于宿主細(xì)胞表面，細(xì)菌黏附作用既有利于細(xì)菌對宿主防御系統(tǒng)的逃逸和在宿主體內(nèi)的定植作用，也有利于激活宿主免疫防御系統(tǒng)；④由于該菌株具有多種抗生素抗性并僅對桿菌肽耐藥，因此可將其直接應(yīng)用于臨床治療，在恢復(fù)腸道菌群平衡、預(yù)防因腸道菌群紊亂引起二重感染的同時，避免患者由于前期大量使用藥物導(dǎo)致后補(bǔ)充的益生菌大量死亡而降低療效；⑤該菌株對外界環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)的特性有助于其在患者體內(nèi)定植，促進(jìn)代謝以提供腸內(nèi)營養(yǎng)，有利于患者機(jī)體功能恢復(fù)，增強(qiáng)治療效果，并能夠解釋該菌株在潛在多重耐藥患者或接受抗生素治療患者的腸道中得以生存的原因。

結(jié)合上述分析結(jié)果，植物乳桿菌PUM1785一旦黏附于宿主細(xì)胞后，利用糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶將多糖水解為單糖，有助于宿主細(xì)胞攝取能量。糖苷水解酶不僅可以水解食物中的糖苷鍵，還可以破壞某些細(xì)菌的生物膜，從而發(fā)揮抑菌作用，對于某些耐藥菌而言，也是很好的生物膜破壞劑[41]。由糖基轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)控形成的蛋白聚糖和糖蛋白因具有不同的核心蛋白而發(fā)揮不同的作用，如用于參與細(xì)胞識別、黏附和免疫識別及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、微生物致病過程和腫瘤轉(zhuǎn)移過程等[42]。糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的任一失活或缺失，都可能導(dǎo)致原有的聚糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致功能缺失或細(xì)胞惡變，糖苷水解酶和糖基轉(zhuǎn)移酶能夠影響細(xì)菌識別宿主細(xì)胞、細(xì)菌黏附功能、致病菌致病過程和腫瘤轉(zhuǎn)移過程[43]。當(dāng)疾病發(fā)生時，可定位蛋白聚糖所對應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)，并成為藥物靶點(diǎn)。

由于植物乳桿菌PUM1785的基因突變類型主要為毒力減弱型，細(xì)菌毒素基因數(shù)量很低且僅對桿菌肽耐藥，故認(rèn)為該菌株無致病性。該菌株表達(dá)的細(xì)菌素類物質(zhì)作為抗生素替代藥物，不僅能夠幫助宿主抵抗病原菌侵襲、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，而且可以用于結(jié)腸癌防治；產(chǎn)生的萜類物質(zhì)具有抗炎、抗腫瘤、抗抑郁、治療糖尿病及神經(jīng)保護(hù)等作用。綜上，植物乳桿菌PUM1785適合作為研發(fā)微生態(tài)制劑的候選益生菌株。