于婷婷，李力群，郝 捷，柴 穎

(內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

蛹蟲草(Cordycepsmilitarys)又名北蟲草、北冬蟲夏草，隸屬于真菌界子囊菌亞門(Ascomycota)肉座菌目(Hypocreales)麥角菌科(Clavicitaceae)，是我國一種兼具食用和藥用珍貴價值的優(yōu)質(zhì)大型真菌[1-2]。研究表明，蛹蟲草含有豐富的生物活性物質(zhì)，如腺苷、蟲草素、蟲草酸、多糖、超氧化物歧化酶、蛋白質(zhì)和氨基酸等，具有增強(qiáng)動物機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗輻射、降血糖、降血脂、延緩衰老等功能，有很高的食藥用價值[3-5]。腺苷、蟲草素等核苷類是蟲草中主要生理活性成分，且腺苷是蟲草素的直接前體。研究發(fā)現(xiàn)，蟲草素具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤等功能，近年已成為蟲草領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一；腺苷即腺嘌呤核苷，在生理代謝過程中起著調(diào)控作用，可用于治療心絞痛、心肌梗塞、動脈硬化、原發(fā)性高血壓及中風(fēng)后遺癥等病癥，常用作蟲草藥材和深加工產(chǎn)品的質(zhì)量檢測指標(biāo)。隨著科技的進(jìn)步，蛹蟲草已實現(xiàn)規(guī)?；斯ぴ耘? 使其資源的研究與開發(fā)在近幾十年取得了很大進(jìn)展, 逐漸成為野生資源不斷減少、亟需保護(hù)的野生冬蟲夏草的替代品，又因其具有極高的營養(yǎng)價值和保健功效,蛹蟲草及其產(chǎn)品已被越來越多的消費(fèi)者所接受, 特別是受到中國、日本和韓國等國家消費(fèi)者的喜愛[6-9]。蛹蟲草菌株CMCX33是具有較強(qiáng)蟲草素、腺苷合成能力的高活性生產(chǎn)母種，子實體采收是其標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；斯ぴ耘嗟闹匾h(huán)節(jié)，試驗通過小規(guī)模人工栽培，考察了蛹蟲草菌株CMCX33不同培養(yǎng)時間的子實體商品性狀、生物學(xué)效率，并對不同培養(yǎng)時間子實體中蟲草素、腺苷含量及收率進(jìn)行比較分析，科學(xué)判定子實體最佳采收時間，為高活性蛹蟲草菌株CMCX33標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；a(chǎn)及合理控制子實體品質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 供試蛹蟲草菌株CordycepsmilitarysCMCX33由遼寧省微生物科學(xué)研究院藥用蕈菌研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①液體菌種培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)：土豆20.00，葡萄糖2.00，硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.10，蛋白胨0.50，pH自然。②麥粒培養(yǎng)基：每盆裝小麥粒450 g，按照1.0∶1.7的比例添加營養(yǎng)液(營養(yǎng)液：硫酸鎂1.0 g，磷酸二氫鉀2.0 g，維生素B15 mg，配制成1 000 mL 溶液，pH自然)。用聚丙烯膜包裹瓶口，并用橡皮筋扎緊，110 ℃保持6 h，冷卻、備用。

1.1.3 主要試劑 葡萄糖、蛋白胨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1均為國產(chǎn)分析純；乙腈為色譜純，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品購自索萊寶生物公司，純度≥98%。

1.1.4 儀器與設(shè)備 電子天平(AL204，梅特勒-托利多儀器有限公司)；中藥粉碎機(jī)(HH30B，鞏義市宏華儀器設(shè)備工貿(mào)有限公司)；高效液相色譜儀(Waters2695，美國waters公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科技有限公司)；80目標(biāo)準(zhǔn)樣篩(上海分樣篩廠)；數(shù)控超聲波儀(KQ-50DA，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 子實體培養(yǎng) 無菌挑取供試菌種新鮮斜面培養(yǎng)物3～4塊(0.2 cm2/塊)于液體培養(yǎng)基中，20 ℃、120 r/min培養(yǎng)4 d；無菌吸取培養(yǎng)液8～10 mL，均勻接種麥粒培養(yǎng)基上，18～20 ℃避光培養(yǎng)7～10 d，當(dāng)培養(yǎng)基質(zhì)表面長滿白色菌絲后，24 h給予300 lx的光照，在培養(yǎng)溫度20 ℃、空氣相對濕度不低于50%、二氧化碳濃度不高于0.5%環(huán)境中進(jìn)行原基誘導(dǎo)培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)20 d左右，菌絲由白色變成均勻的橘黃色，且形成針尖狀原基時，扎眼通氣，進(jìn)入子實體培養(yǎng)階段；分別采收不同培養(yǎng)時間的子實體，備用。共進(jìn)行3個批次的栽培試驗，每個批次2 000盆(每盆培養(yǎng)料450 g)。

1.2.2 不同培養(yǎng)時間子實體商品性狀觀察及生物學(xué)效率測定 記錄菌株CMCX33不同培養(yǎng)時間(35、45、55、60、65、70、75 d)子實體的色澤、高度、整齊度、長勢，并按照下式計算子實體生物學(xué)效率：生物學(xué)效率(%)=(子實體鮮質(zhì)量(g)/培養(yǎng)基干質(zhì)量(g))×100%。

1.2.3 不同培養(yǎng)時間子實體蟲草素、腺苷含量測定 參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn) NY/T 2116-2012(蟲草制品中蟲草素、腺苷的測定)方法進(jìn)行含量測定。①蟲草素、腺苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別精密稱取蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，去離子水溶解，流動相定容至100 mL，搖勻，即為混合標(biāo)準(zhǔn)品母液，蟲草素及腺苷的質(zhì)量濃度分別為100 μg/mL，4 ℃儲存、備用。②色譜條件：色譜柱為ZOXBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；waters2489型二極管陣列檢測器；柱溫35 ℃；流動相：V水∶V乙腈=95∶5；流速1.0 mL/min；檢測波長260 nm；進(jìn)樣量10 μL。③標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：分別準(zhǔn)確吸取蟲草素、腺苷混合標(biāo)準(zhǔn)品母液0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、12.50 mL于25 mL容量瓶中，去離子水定容，搖勻，得到蟲草素及腺苷的質(zhì)量濃度分別為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL；過0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜進(jìn)樣分析。記錄相應(yīng)峰面積，分別以蟲草素、腺苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。④樣品測定：分別取菌株CMCX33不同培養(yǎng)時間(35、45、55、60、65、70、75 d)的新鮮子實體，于55 ℃鼓風(fēng)干燥至恒質(zhì)量，粉碎，過80目篩，備用。準(zhǔn)確稱取待測樣品粉末0.500 0 g，置于100 mL容量瓶中，加入去離子水80 mL超聲波儀中超聲提取3 h，去離子水定容，搖勻后，濾紙過濾，收集濾液，用針頭過濾器過0.22 μm微孔濾膜，上樣分析。每個樣品3份平行樣。以蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間定性，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計算樣品液中腺苷、蟲草素的質(zhì)量濃度，按下式計算樣品中腺苷、蟲草素含量：樣品活性物質(zhì)含量(mg/g)=(樣品液質(zhì)量濃度(mg/mL)×樣品液體積(mL))/樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

由圖1、圖2可以看出，在選定的色譜條件下，樣品與標(biāo)準(zhǔn)對照品在相同的保留時間內(nèi)出現(xiàn)了蟲草素、腺苷特征圖譜；蟲草素及腺苷在0～50.0 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，計算得腺苷回歸方程：Y=30 213X+10 109(R2=0.999 7)；蟲草素回歸方程:Y=31 125X+14 250(R2=0.999 2)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖

圖2 供試樣品液HPLC色譜圖

2.2 不同培養(yǎng)時間子實體商品性狀觀察及生物學(xué)效率測定

按照1.2.1的方法，對菌株CMCX33進(jìn)行了3批次栽培試驗，觀察不同培養(yǎng)時間(35、45、55、60、65、70、75 d)子實體長勢，并對生物學(xué)效率進(jìn)行測定。結(jié)果(圖3、圖4)顯示：培養(yǎng)35～65 d時，子實體均長勢旺盛、色澤金黃、頭部膨大、條形勻稱，呈現(xiàn)良好的商品性狀,隨著培養(yǎng)時間的增加，子實體生物學(xué)效率明顯提高，培養(yǎng)65 d時，生物學(xué)效率最高，達(dá)103.0%；隨著培養(yǎng)時間的增加，子實體生長進(jìn)入衰退期，子實體逐漸出現(xiàn)彎曲、根部變白、色澤變淺、發(fā)軟易斷等衰退現(xiàn)象，生物學(xué)效率呈明顯下降趨勢?？梢?，培養(yǎng)65 d菌株CMCX33的商品性狀最佳、生物學(xué)效率最高。農(nóng)藝性狀是鑒別食用菌菌種的重要指標(biāo)之一，而蟲草素、腺苷是蛹蟲草子實體中重要的活性物質(zhì)，目前普通的栽培者只注重栽培產(chǎn)量，而忽略產(chǎn)品功能的重要性[10-12]。為更好地發(fā)揮蛹蟲草保健功效，有必要對試驗菌株子實體中的蟲草素、腺苷含量、收率進(jìn)一步考察，明確子實體生長過程中蟲草素、腺苷含量和收率的變化規(guī)律，科學(xué)判定采收時間，對菌株CMCX33高品質(zhì)栽培及高效利用具有重要指導(dǎo)意義。

圖3 不同培養(yǎng)時間菌株CMCX33子實體長勢

圖4 不同培養(yǎng)時間菌株CMCX33的生物學(xué)效率

2.3 不同培養(yǎng)時間菌株CMCX33子實體中蟲草素、腺苷含量測定

在對不同培養(yǎng)時間菌株CMCX33子實體商品性狀及生物學(xué)效率考察基礎(chǔ)上，對不同培養(yǎng)時間子實體中蟲草素、腺苷含量進(jìn)行了測定，并結(jié)合生物學(xué)效率，對不同培養(yǎng)時間子實體中蟲草素、腺苷的收率進(jìn)行了比較分析。結(jié)果(圖5、圖6)表明：在培養(yǎng)早期(35～55 d)，腺苷含量呈快速累積趨勢，培養(yǎng)55 d時，腺苷含量達(dá)到較高水平(2.42 mg/g)，隨著培養(yǎng)時間的增加，腺苷平均含量出現(xiàn)小幅度下降，腺苷含量趨于相對穩(wěn)定，其收率隨著生物學(xué)效率提高而增加，培養(yǎng)65 d時，腺苷收率最高(平均收率0.23%)；而蟲草素含量呈先快速增加后減少的趨勢，其中在培養(yǎng)早期(35～55 d)呈緩慢增加趨勢，55～65 d為顯著提升階段，子實體中蟲草素含量及收率增加幅度較大，培養(yǎng)65 d時，達(dá)到較高水平，平均含量達(dá)到4.40 mg/g，培養(yǎng)70 d時，子實體中蟲草素含量達(dá)到峰值(平均含量4.79 mg/g)，但該時期子實體的生長進(jìn)入衰退期，個別子實體變軟，生物學(xué)效率有所下降，蟲草素總收率與培養(yǎng)周期65 d的子實體相同(蟲草素平均收率0.44%)。綜合不同培養(yǎng)時間子實體商品性狀、生物學(xué)效率、子實體中蟲草素及蟲草酸含量、收率等各因素，明確高活性蛹蟲草菌株CMCX33在規(guī)?；a(chǎn)中最佳采收時期為65 d。

圖5 不同培養(yǎng)時間菌株CMCX33子實體中蟲草素、腺苷含量

圖6 不同培養(yǎng)時間菌株CMCX33子實體中蟲草素、腺苷收率

3 討 論

隨著大健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，人們生活水平不斷提高，保健意識不斷增強(qiáng)，對功能保健產(chǎn)品的需求量不斷增加，極大地促進(jìn)了蛹蟲草子實體應(yīng)用研究的發(fā)展。越來越多的蛹蟲草生產(chǎn)企業(yè)在關(guān)注子實體產(chǎn)量的同時，對蟲草素、腺苷等有效活性成分的含量提出更高要求。目前，有關(guān)通過優(yōu)良菌種選育、優(yōu)化培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基配方等方法提高蛹蟲草子實體中蟲草素、腺苷含量的研究報道較多[13-15]，而對于蛹蟲草菌株在人工培養(yǎng)過程中蟲草素、腺苷含量變化規(guī)律的研究報道較少，探索、優(yōu)化蛹蟲草標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)，依據(jù)子實體應(yīng)用目的、農(nóng)藝性狀、主要活性成分含量變化趨勢，科學(xué)選擇子實體采收時間，是保障蛹蟲草子實體品質(zhì)、實現(xiàn)高品質(zhì)生產(chǎn)的重要手段之一。

研究表明，試驗范圍內(nèi)，不同培養(yǎng)周期的蛹蟲草子實體中蟲草素、腺苷含量及變化趨勢存在明顯差異，子實體的農(nóng)藝性狀、生物學(xué)效率在一定程度上影響上述成分的收率。試驗通過對不同培養(yǎng)時間的高活性蛹蟲草菌株CMCX33子實體農(nóng)藝性狀品質(zhì)、生物學(xué)效率及蟲草素、腺苷含量、收率的測定及差異化分析，明確了高活性蛹蟲草菌株CMCX33最佳采收時期為65 d，為其應(yīng)用研究及標(biāo)準(zhǔn)化栽培技術(shù)規(guī)程的建立提供參考。