劉鵬，魏紀平，李超，袁文蛟，劉皓，李達

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術學院，天津 300350）

近年來，致病菌快速檢測成為研究熱點[1-2]。目前致病菌檢測的方法很多，有經(jīng)典生理生化法、16S rRNA檢測法、多位點測序與擴增片段長度多態(tài)性技術等，而利用基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS/MS）蛋白鑒別微生物，是近幾年發(fā)展起來的新方法[3-5]，該方法有不同的研究方向，其中利用核糖體蛋白保守性對微生物進行鑒別，是一種簡單、快速的檢測方法，但是該方法也面臨諸多問題，主要是核糖體蛋白質(zhì)譜檢出率低，其蛋白檢出數(shù)量很難達到鑒別微生物的要求[6-9]。

為達到MALDI-TOFMS/MS快速檢測微生物要求，本文引入金屬-有機骨架材料（metal organic framework，MOFs）對微生物和核糖體蛋白進行快速富集，提高質(zhì)譜檢測的靈敏性和分辨率，以達到微生物鑒別的目的。目前，在MOFs材料中MIL-101是最常用的富集介孔材料，而且具有優(yōu)良的蛋白富集能力[10-11]。本文通過合成Fe3O4-COOH@MIL-101納米粒子，利用其帶電性和介孔的富集特性達到快速富集菌體和核糖體蛋白，并利用核糖體蛋白微生物鑒別數(shù)據(jù)庫對Escherichia coli O157∶H7 進行鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、檸檬酸鈉、乙二醇、Cr（NO3）3·9H2O、苯二甲酸（均為分析純）：天津市光復精細化工研究所；α-腈基-4-羥基苯丙烯酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）：美國布魯克·道爾頓公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）（色譜純）、乙腈（acetonitrile，ACN）（色譜純）：美國杰帝貝柯公司。

Autoflex III型基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜：美國布魯克·道爾頓公司；BSP-100型振蕩培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；DynaMag-2型磁性分離器：美國賽默飛世爾科技公司；TU-1901型紫外可見吸收分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；JEM-2100F型透射電子顯微鏡：日本電子株式會社；Miniflex 600型X射線衍射儀：日本理學株式會社；VSM1100型振動探針式磁強計：美國蘭道科技公司；TriStar 3000型比表面儀：美國麥克默瑞提克有限公司；Zetasizer Nano ZSP型納米粒度電位儀：英國馬爾文儀器有限公司。

1.2 Fe3O4-COOH@MIL-101合成

Fe3O4-COOH@MIL-101采用Bromberg等[12]的水熱法進行合成。

1.3 Fe3O4-COOH@MIL-101表征

透射電鏡圖像（transmission electron microscope，TEM）是在200 kV加速電壓下通過JEM-2100F TEM進行表征磁性MOFs復合物。磁性MOFs復合物的高分辨率的X射線衍射數(shù)據(jù)是由X射線衍射儀（CuKα射線源λ=1.541 8?）完成，記錄磁性MOFs復合物的晶體結(jié)構(gòu)。磁性MOFs復合物的磁力分析是在25℃條件下通過振動樣品磁強度計對材料的磁性進行表征。磁性MOFs復合物的表面積、孔體積、孔徑分布的測量是在77 K，0.02 ≤ P/P0≤0.20（P 為氮氣分壓，P0為液氮溫度下氮氣的飽和蒸汽壓）條件下，利用比表面儀采集磁性MOFs復合物的比表面積和孔徑數(shù)據(jù)。

1.4 Fe3O4-COOH@MIL-101等電點測定

把Fe3O4-COOH@MIL-101加入到不同pH值的磷酸緩沖液中，利用納米粒度電位儀測定Fe3O4-COOH@MIL-101等電點。

1.5 菌液培養(yǎng)

在 37°C 下，E.coli O157∶H7接種于 25 mL 滅菌胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中，搖床120 r/min培養(yǎng)16 h后，1 mL 細菌菌懸液離心（12 000 r/min）5 min，倒出上清液，并用磷酸鹽緩沖液清洗2次，然后利用紫外可見吸收分光光度計600 nm波長調(diào)整到所需的濃度，并利用活菌計數(shù)法對其進行計數(shù)。

1.6 Fe3O4-COOH@MIL-101富集與MALDI-TOF MS/MS檢測

把20 μL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制 MIL-101磁性顆粒懸濁液（10 mg/mL）加入到1 mL含有致病菌懸濁液的離心管中，渦旋振蕩5 min，使MIL-101磁性顆粒吸附到菌體表面，然后把離心管放入微波爐中，微波輻射30 s破壁，然后加入2 mmol/L十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS），振蕩30 min富集蛋白，磁性分離5 min，去除上清液，加入 20 μL 乙腈與 0.1% 三氟乙酸（體積比 1∶1），渦旋振蕩3 min洗脫菌體蛋白，磁性分離5 min，把1 μL上清液移到MALDI-TOF MSMS靶盤待測，加入基質(zhì)CHCA后，采用MALDI-TOF MSMS線性模式進行分析。

1.7 微生物鑒別

利用Flexanalysis軟件（version 3.0；Bruker Daltonics）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行基線校正、平滑和標峰。然后利用 Tagident搜索工具（http：//web.expasy.org/tagident/）對質(zhì)譜峰進行數(shù)據(jù)庫檢索 （UniProtKB/Swiss-Prot和UniProtKB/TrEMBL）確定蛋白。利用得到的核糖體蛋白搜索微生物快速鑒別數(shù)據(jù)庫（Rapid Microorganism Identification Database；http：//rmidb.org）確定致病菌菌株水平歸屬。

Tagident搜庫參數(shù)為數(shù)據(jù)庫：Swiss-Prot/TrEMBL；質(zhì)量差：±3 Da；pI=0～14；生物類別：Escherichia coli O157∶H7

1.8 模擬樣本E.coli O157∶H7分析與鑒別

從超市中購買碳酸飲料，加入活菌計數(shù)完畢的E.coli O157∶H7的菌懸液，然后利用MIL-101磁性顆粒富集與輔助微波破壁，MALDI-TOF MSMS檢測，并利用數(shù)據(jù)庫進行菌株鑒別。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3O4-COOH@MIL-101表征

Fe3O4-COOH@MIL-101合成完之后，利用透射電子顯微鏡、X射線衍射、磁滯回線和N2吸附-解吸等溫曲線對Fe3O4-COOH@MIL-101合成效果進行表征，以證明其成功合成，表征結(jié)果如圖1所示。

圖1 Fe3O4-COOH@MIL-101的表征Fig.1 Characterization of Fe3O4-COOH@MIL-101

透射電鏡圖直觀表征了Fe3O4-COOH@MIL-101的大小和表面特征。圖1A證實了Fe3O4-COOH納米粒子的非均勻黏附在MIL-101晶體的表面，表明MIL-101晶體成功被磁化。為進一步證實磁性MOFs材料的存在，X射線衍射用來研究Fe3O4-COOH@MIL-101合成是否成功。從圖1B可以看出，F(xiàn)e3O4-COOH納米粒子與Fe3O4-COOH@MIL-101的衍射角在30°～70°范圍內(nèi)相匹配；而模擬的MIL-101晶體的衍射角2θ數(shù)據(jù)在0°～10°范圍內(nèi)與Fe3O4-COOH@MIL-101相匹配，這證明Fe3O4-COOH@MIL-101被成功合成。磁滯回線顯示了Fe3O4-COOH@MIL-101磁化性能，從圖1C可以看出，F(xiàn)e3O4-COOH@MIL-101磁化值為10.1emu/g，雖然其磁化值較Fe3O4-COOH低，但是其磁化值足夠從水溶液中快速分離Fe3O4-COOH@MIL-101。利用氮氣吸附來證實Fe3O4-COOH@MIL-101介孔性質(zhì)，由圖1D可知，所制備的Fe3O4-COOH@MIL-101復合材料具有的表面積為592.7 m2/g，孔體積為0.256 cm3/g，其孔徑長約2.2 nm。氮氣吸附數(shù)據(jù)表明Fe3O4-COOH@MIL-101可以足夠用來吸附蛋白。

2.2 Fe3O4-COOH@MIL-101富集能力和MALDI-TOF MS/MS檢測限

Fe3O4-COOH@MIL-101的富集能力是提高MALDITOF MS/MS檢測微生物靈敏性的關鍵，常規(guī)MALDITOF MS/MS溶劑法檢測微生物的濃度限值在105CFU/mL～106CFU/mL。圖2是利用Fe3O4-COOH@MIL-101對不同濃度大腸桿菌富集的質(zhì)譜檢測結(jié)果，以此來驗證Fe3O4-COOH@MIL-101富集能力和MALDI-TOF MS/MS的檢測限。

由圖2A可知，未利用Fe3O4-COOH@MIL-101富集的方法檢測E.coli O157∶H7的濃度為6.0×105CFU/mL時，幾乎沒有質(zhì)譜信號出現(xiàn)；而當添加Fe3O4-COOH@MIL-101（濃度為10 mg/mL）時，質(zhì)譜信號顯著增強，質(zhì)譜峰的數(shù)量明顯增加（圖2B），這主要是因為Fe3O4-COOH@MIL-101帶正電，納米粒度電位儀測定Fe3O4-COOH@MIL-101等電點為8.0，因此帶正電的納米粒子和帶有負電的大腸桿菌細胞快速結(jié)合，當利用微波破壁時，蛋白可以快速的釋放到含有2 mmol/LSDS溶液中，SDS可以提高蛋白的溶解性；另外Fe3O4-COOH@MIL-101比表面積大，富集能力強，能吸附大量溶液中的蛋白，因此利于質(zhì)譜檢測。

但是當溶液中的菌體濃度逐漸降低時，MALDITOF MS/MS的檢測能力逐漸下降（圖2C），這主要是溶液中可溶解的蛋白降低的緣故，因為SDS的濃度不能添加過多，當SDS的濃度超過5 mmol/L時，SDS就會明顯壓制質(zhì)譜信號。因此當大腸桿菌菌體濃度達到6.0×103CFU/mL時，質(zhì)譜信號變得微弱，而且質(zhì)譜峰的數(shù)量也大大減少，但是MALDI-TOF MS/MS仍能檢測到蛋白信號，只是其蛋白數(shù)量不能用來鑒別微生物，因此Fe3O4-COOH@MIL-101富集后能鑒別微生物的檢測限為6.0×104CFU/mL。

圖2 Escherichia coli O157∶H7的富集與檢測限Fig.2 Enrichment and detection limit of Escherichia coli O157∶H7

2.3 模擬樣本檢測

為驗證該方法在實際檢測中的效果，把碳酸飲料中添加不同濃度的E.coli O157∶H7構(gòu)成模擬實際樣本。通過模擬實際樣本，檢驗Fe3O4-COOH@MIL-101在實際檢驗中的富集能力，如圖3所示。

圖3 模擬樣本中Escherichia coli O157∶H7的檢測Fig.3 Detection of E.coli O157∶H7 in simulation samples

圖3顯示利用Fe3O4-COOH@MIL-101富集后，模擬樣本中能鑒別微生物的檢測限為6.0×105CFU/mL。這主要是因為隨著菌體濃度降低，可溶解在溶液中的蛋白減少，而且碳酸飲料中雜質(zhì)離子對質(zhì)譜信號的壓制非常顯著。雖然在菌體富集后，利用去離子水對其進行清洗，但是效果仍不明顯，可能是有些菌體被洗脫掉，而造成檢測結(jié)果不理想。

在模擬樣本中，當菌體濃度為6.0×105CFU/mL時，MALDI-TOF MS/MS檢測信號強，核糖體蛋白數(shù)量多，如表1所示，根據(jù)Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果，E.coli O157∶H7有更多的核糖體蛋白被檢測。這樣利于微生物鑒別數(shù)據(jù)庫檢索，提高了E.coli O157∶H7鑒別的準確性，經(jīng)微生物鑒別數(shù)據(jù)庫檢索可以確認模擬樣本中的微生物為E.coli O157∶H7。

表1 大腸桿菌O157∶H7蛋白Swiss-Prot/TrEMBL數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果Table 1 Search results of E.coli O157∶H7 protein in Swiss-Prot/TrEMBL database

由表1可知，其主要質(zhì)譜峰中，共有7個核糖體蛋白，它們的分子量分別是 9 193、7 870、7 273、6 241、5 383、5 096、4 363 Da，它們分別是核糖體大小亞基蛋白。利用Fe3O4-COOH@MIL-101富集后可得到更多的核糖體蛋白，通過利用核糖體蛋白的保守性，可以對微生物進行鑒別，這主要是因為核糖體蛋白不僅為菌體中高峰度蛋白，而且為堿性蛋白，其等電點大都在10.0以上，當控制溶液pH 9.0時，F(xiàn)e3O4-COOH@MIL-101帶負電（等電點為8.0），核糖體蛋白帶正電，F(xiàn)e3O4-COOH@MIL-101不僅可以利用孔徑吸附蛋白，而且可以利用帶電性對核糖體蛋白進行富集，因此提高核糖體蛋白檢出率，從而利于微生物的鑒別。

3 結(jié)論

本文通過合成Fe3O4-COOH@MIL-101納米材料，利用該材料的帶電性和介孔的富集能力，通過Fe3O4-COOH@MIL-101對菌體和蛋白的兩次富集，提高了MALDI-TOFMS/MS檢測的靈敏性，使其對E.coliO157∶H7的檢測限達到6.0×104CFU/mL，而利用模擬樣本對其 E.coli O157∶H7 的檢測限達到 6.0×105CFU/mL，同時利用核糖體蛋白搜索微生物快速鑒別數(shù)據(jù)庫完成對 E.coli O157∶H7 的鑒別。