尚柯，張敏，張彪，王巍，段慶梓，張玉，雍溶，葉梅*

（1.成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川 成都 611135；2.湖南大學(xué)生物學(xué)院，湖南 長沙 410012）

隨著市場全球化及貿(mào)易自由化的不斷發(fā)展，消費(fèi)者對肉制品產(chǎn)品質(zhì)量和真實(shí)性越來越重視，肉制品安全提升到一個(gè)新的高度[1-2]，食品領(lǐng)域經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)型摻假行為對食品安全和食品貿(mào)易造成嚴(yán)重危害[3]。目前，肉制品的摻假主要表現(xiàn)為原料肉摻假、組織替換等[4]，這些真實(shí)性問題不但侵害了消費(fèi)者利益，而且給肉制品食用安全帶來潛在危害，同時(shí)也可能帶來宗教信仰和道德標(biāo)準(zhǔn)方面的風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，肉制品動(dòng)物源性成分檢測變得越來越重要，核酸檢測可以從樣品中檢測出痕量目標(biāo)分子，具有靈敏性和特異性等諸多優(yōu)勢，已成為食品真實(shí)性研究中必要的技術(shù)手段[6]，并在檢測領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。但是，傳統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、儀器及人員要求較高，無法滿足現(xiàn)場檢測監(jiān)管需求。近年來，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（recombinase polymerase amplification，RPA）[7]發(fā)展迅速[8]，在醫(yī)療診斷[9-11]、農(nóng)業(yè)[12-14]、食品[15-16]等方面的應(yīng)用越來越廣泛，該技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)了核酸檢測在現(xiàn)場中的應(yīng)用，因不需要高溫變性、退火等步驟，對精密儀器依賴程度大大降低，是實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場即時(shí)檢測的有效技術(shù)手段。

多酶恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)（multienzyme isothermal rapid amplification，MIRA）是在RPA技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，在37℃條件下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ss－DNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白（single strand DNA-binding protein，SSB）的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時(shí)，聚合酶也結(jié)合到引物的3′末端，開始鏈的延伸，依賴核酸內(nèi)切酶（nfo酶）的作用，加入根據(jù)模板設(shè)計(jì)的特異性分子探針，結(jié)合膠體金核酸檢測試紙條（lateral flow dipstick，LFD）從而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物快速檢測，該方法與側(cè)流式膠體金法有機(jī)結(jié)合，不僅能達(dá)到簡捷、靈敏、特異的檢測目的，而且能更好地為現(xiàn)場動(dòng)物源性成分檢測提供可視化應(yīng)用服務(wù)。多酶恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)原理見圖1。

圖1 多酶恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)原理圖Fig.1 Schematic diagram of multienzyme isothermal rapid amplification

MIRA技術(shù)在用于鴨源性檢測方面具有多項(xiàng)優(yōu)勢[17]：在特殊酶的作用下，DNA模板不需要高溫循環(huán)變性擴(kuò)增，對儀器的要求大大降低[18]；具有快速反應(yīng)的特點(diǎn)，樣本與試劑一接觸便開始反應(yīng)，20 min內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果[19]；可檢測單鏈DNA與雙鏈DNA，檢測范圍較廣[20]；目前商品化試劑盒較多，操作簡便，無需復(fù)雜的培訓(xùn)即可開展檢測工作。因此，MIRA技術(shù)用于鴨源性檢測具備良好的適用性。

本研究旨在提高肉制品中鴨源性成分檢測方法的可操作性，建立健全肉制品動(dòng)物源性的檢測方法，針對鴨肉制品建立專屬性多酶恒溫側(cè)流式擴(kuò)增技術(shù)（MIRA-LFD）檢測方法，為鴨源性成分現(xiàn)場檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

動(dòng)物基因組提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒：濰坊安普未來生物科技有限公司；側(cè)流式膠體金試紙條：德國Milenia Biotec公司；引物及探針：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q Academic實(shí)驗(yàn)室超純水儀：美國Millipore公司；MM400行星球磨儀：德國Retsch公司；Cen－trifuge 5427 R高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；ME2002E電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；BSA224S電子天平：德國賽多利斯公司；MK3渦懸振蕩器：德國IKA公司；P330核酸蛋白定量儀：德國Implen公司；Thermo-Shaker BG-100干式恒溫器：杭州瑞誠儀器有限公司；GelDoc-It凝膠成像儀：美國UVP公司。

1.3 樣品信息

本試驗(yàn)所用樣品包括豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、狐貍、貂、貓、海貍鼠共10個(gè)物種。樣品采自養(yǎng)殖廠、研究所、農(nóng)貿(mào)市場、電商、超市等。所有樣品通過合成引物[21-22]進(jìn)行線粒體基因測序驗(yàn)證，保證樣品的真實(shí)性[23]。

2 試驗(yàn)過程

2.1 引物探針設(shè)計(jì)

鴨源性CYTB基因序列和核糖體12S基因序列來自Genbank網(wǎng)站（登錄號為L07521.1和U59666.1），并上傳至網(wǎng)站進(jìn)行序列對比，對比結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 鴨CYTB基因比對結(jié)果Fig.2 Comparison of duck CYTB gene

圖2～圖3對比結(jié)果表明CYTB基因和核糖體12S基因?qū)τ邙喸葱詸z測有良好的特異性，可用于設(shè)計(jì)鴨源性檢測的特異MIRA引物和探針。在引物設(shè)計(jì)時(shí)，選擇堿基排布隨機(jī)性高、鳥嘌呤和胞嘧啶所占比率在30%～70%之間的引物序列，并且在下游引物的5′端標(biāo)記生物素（biotin）修飾基團(tuán)；對于MIRA法的探針序列，應(yīng)避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基，長度一般在 46 nt～52 nt，在 5′端修飾一個(gè) 6-羧基熒光素（6-carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）標(biāo)記，在距 5′端約30 nt序列位置上標(biāo)記一個(gè)四氫呋喃（tetrahydrofuran，THF），作為核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，另外THF距離3′末端約15 nt，并且3′末端標(biāo)記一個(gè)C3-spacer修飾基團(tuán)。

根據(jù)以上設(shè)計(jì)原則，共設(shè)計(jì)11條引物及所對應(yīng)的2條探針，引物名稱及序列如表1所示。

表1 引物探針信息Table 1 Details of primers and probe

按照不同目的片段來源將這些引物探針分為a組（CYTB基因）和b組（核糖體12S），在a組和b組內(nèi)對這些引物和探針開展3×3試驗(yàn)，共15個(gè)組合，以期獲得最適合的引物探針。引物探針正交組合見表2。

表2 引物探針正交組合Table 2 Orthogonal combinations of primers and probe

2.2 MIRA-LFD方法建立

2.2.1 DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書對樣品進(jìn)行基因組提取，用核酸蛋白定量儀確定DNA提取的效率與純度，進(jìn)行OD260/OD280值測定，測得值均在1.7～2.0之間，表明可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 陽性對照試驗(yàn)

MIRA陽性對照反應(yīng)體系（50 L）包括29.4 L的A緩沖液，1.0 μL鴨源性核酸模板和2.5 μL B緩沖液，每套引物各 0.25 μL，并用去離子水補(bǔ)齊 50 μL，設(shè)立以去離子水為DNA模板的空白對照組；同時(shí)以MIRA試劑盒提供的正對照模板單元作為試驗(yàn)質(zhì)控對照。正對照體系配制：正對照模板加入2 μL，引物加入4 μL正對照引物Mix（包含上/下游引物），其它組分如上體系配制。產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠做水平電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

2.2.3 空白對照試驗(yàn)

MIRA-LFD 空白對照反應(yīng)體系（50 μL）包括29.4 μL 的 A 緩沖液，1.0 μL 去離子水和 2.5 μL B 緩沖液，每套引物各 0.25 μL，探針 0.075 μL，并用去離子水補(bǔ)齊50 μL。其中，空白對照為去離子水。

2.2.4 陰性對照試驗(yàn)

MIRA-LFD陰性對照反應(yīng)體系（50μL）包括29.4 μL的A緩沖液，1.0 μL陰性對照核酸模板和2.5 μL B緩沖液，每套引物各 0.25 μL，探針 0.075 μL，并用去離子水補(bǔ)齊50 μL。其中，陰性對照分別為豬、牛、羊、雞、鵝、狐貍、貂、貓和海貍鼠樣品提取的DNA模板。

2.3 檢出限試驗(yàn)

稱取200 mg左右的鴨肉和雞肉組織，分別轉(zhuǎn)移至2.0 mL的離心管中。然后向每個(gè)離心管加入400 mg ACL溶液（由DNA提取試劑盒提供）和20 mg的蛋白酶K溶液（由DNA提取試劑盒提供）。充分振蕩混勻，置于55℃過夜裂解，直至樣品裂解完全。檢出限試驗(yàn)樣品信息見表3。

表3 檢出限試驗(yàn)樣品信息Table 3 Sample information of detection limit experimental

樣品完全裂解后，按照如下公式計(jì)算1 mg相應(yīng)的組織材料所對應(yīng)的裂解液質(zhì)量（x），以鴨肉組織裂解液為樣品，以雞肉組織裂解液為本底配制10%、1%、0.1%和0.01%（質(zhì)量比）的模擬樣本。分別對這些模擬樣本進(jìn)行DNA提取，依照建立的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

式中：x為1 mg相應(yīng)的組織材料所對應(yīng)的裂解液質(zhì)量，mg；a為供試樣品組織質(zhì)量，mg。

2.4 MIRA-LFD與熒光定量PCR結(jié)果對比

熒光定量 PCR反應(yīng)[24]采用 25 μL體系，包括12.5 μL的 2×MasterMix，上游引物 FP（5′-GGCCACACAAATCCTCACAG-3′，900 nmol/L）、下游引物 RP（5′-TGTGTTGGCTACTGAGGAGAAA-3′，900 nmol/L）和探針（5′-FAM-CCTACTGGCTATGCACTACACCGCAGACTAMRA-3′，250 nmol/L）各 2.0 μL，所用 DNA 模板與2.3中相同，用去離子水補(bǔ)齊25 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件 50℃ 2 min→95℃ 10 min→40×（95℃ 15 s→60℃1 min）收集熒光信號。檢測結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）讀取結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 陽性對照試驗(yàn)結(jié)果

鴨CYTB基因陽性對照正交試驗(yàn)比對結(jié)果見圖4。鴨核糖體12S陽性對照正交試驗(yàn)比對結(jié)果見圖5。

圖4 鴨CYTB基因陽性對照正交試驗(yàn)比對結(jié)果Fig.4 Comparison results of duck CYTB gene positive control by orthogonal experiment

圖5 鴨核糖體12S陽性對照正交試驗(yàn)比對結(jié)果Fig.5 Comparison of duck ribosomal 12S gene positive control by orthogonal experiment

由圖4、圖5可知，比較表2中的15套引物與試劑盒配套陽性對照結(jié)果，15對引物組合陽性對照均出現(xiàn)條帶，但其中C、F組合空白對照結(jié)果出現(xiàn)明顯引物二聚體，因此篩選其它13對組合與相應(yīng)的探針進(jìn)行空白對照試驗(yàn)。

3.2 空白對照試驗(yàn)結(jié)果

向陽性對照試驗(yàn)篩選出的13對引物加入其相對應(yīng)探針進(jìn)行MIRA-LFD反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 鴨源性空白對照正交試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 The results of duck derived blank control by orthogonal experiment

圖6為15對鴨源性引物探針MIRA-LFD空白結(jié)果，4對引物探針組合空白對照未出現(xiàn)T線，表明未出現(xiàn)非特異結(jié)合；其余11對引物探針均出現(xiàn)T線，因此選擇4對未出現(xiàn)T線的引物探針組合（組合I、K、M、N）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.3 陰性對照試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，篩選空白對照中未出現(xiàn)檢測線（T線）的引物探針組合進(jìn)行陰性對照試驗(yàn)。其中，試驗(yàn)對象分別為豬、牛、羊、雞和鴨樣品提取的DNA模板。膠體金結(jié)果如圖7所示。

圖7 陰性對照篩選預(yù)試驗(yàn)Fig.7 Negative results pre-test

如圖7中的4對引物探針陰性對照結(jié)果，組合N陰性對照未出現(xiàn)T線，表明未出現(xiàn)非特異結(jié)合。在此基礎(chǔ)上增加陰性對照物種數(shù)，進(jìn)一步考察這對引物探針組合的特異性，膠體金結(jié)果如圖8所示。

圖8 陰性對照篩選試驗(yàn)Fig.8 Negative results test

如圖8所示，組合N在牛、羊、豬、雞、鵝、狐貍、貂、貓和海貍鼠為陰性，表現(xiàn)出良好的特異性，未出現(xiàn)明顯的非特異性結(jié)合，因此將組合N作為MIRA-LFD方法檢測鴨源性成分的引物探針組合。

3.4 檢出限試驗(yàn)與對比試驗(yàn)結(jié)果

檢出限試驗(yàn)是通過將鴨肉酶解液與雞肉酶解液混合制備得到的不同濃度的模擬樣品（10%、1%、0.1%和0.01%，質(zhì)量比），以比較MIRA-LFD法同熒光定量PCR法在檢測鴨源性成分時(shí)的最低檢出限，試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。

圖9 檢出限比對試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Comparison of detection limit results

由圖9可知，MIRA-LFD模擬樣品在鴨源性成分為0.1%時(shí)仍能呈現(xiàn)陽性結(jié)果，說明模擬樣品的檢測限為0.1%，與熒光定量PCR法結(jié)果一致。但是在現(xiàn)場檢測中，膠體金0.1%結(jié)果顏色較淺，不易辨別，因此鴨源性成分MIRA-LFD檢測線為1%。

4 討論與結(jié)論

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)近幾年的發(fā)展非常迅速，在分子檢測領(lǐng)域越來越重要，但是由于相關(guān)軟件支持的滯后，引物探針的設(shè)計(jì)還停留在人工檢索階段。MIRA-LFD檢測方法源于RPA技術(shù)，篩選引物的過程中，不但一些陽性結(jié)果出現(xiàn)了大小不一的非特異性條帶，一些空白結(jié)果也出現(xiàn)了彌散條帶，后期試驗(yàn)說明該檢測方法需要找到反應(yīng)后無非特異性條帶，且在空白對照中特異性條帶的位置上無條帶出現(xiàn)的引物。在篩選引物的過程中，能夠滿足條件的引物較少，為此進(jìn)行了大量的正交試驗(yàn)，花費(fèi)時(shí)間較多。

本研究成功篩選出肉制品中鴨源性成分的MIRA-LFD檢測體系的最優(yōu)引物探針組合，與此同時(shí)，對所篩選方法的特異性、檢出限分別進(jìn)行了評價(jià)，證明了該組合所建立的檢測體系特異性強(qiáng)、靈敏度高。通過與現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)室檢測方法進(jìn)行比對試驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法實(shí)際應(yīng)用的有效性，在實(shí)際工作尤其是現(xiàn)場檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。