尹明松，丁賀輝，潘飛兵，匡鳳姣，冀曉龍*，劉延奇*

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2.海南華創(chuàng)檳榔研究院，海南 海口 571600；3.海南口味王科技發(fā)展有限公司，海南 萬寧 571542）

檳榔（Areca catechu L.）為棕櫚科（Palmaceae）檳榔屬（Areca）常綠喬木，其干燥的成熟種子稱為檳榔（Semen Arecae），又名橄欖子、大腹子、青仔、榔玉等，廣泛分布于我國南部熱帶、亞熱帶地區(qū)[1-2]。檳榔為我國“四大南藥”之首，在我國中醫(yī)藥的應用已超過千年；《本草綱目》中記載，檳榔具有“下水腫、通關節(jié)、健脾調中、治心痛積聚”等功效；其味辛、苦，性溫，歸胃、大腸經(jīng)，具有消積殺蟲、行水降氣等功效，是常用的驅蟲消積的藥物，主治人體腸道寄生蟲、食積腹痛、水腫脹滿等[3]?，F(xiàn)代研究表明，檳榔含有多種活性成分，包括生物堿、黃酮、單寧、三萜、甾體、多糖、脂肪酸、氨基酸等多種成分[4]，具有促消化、降血糖、抗抑郁、抗氧化、抗炎、抗寄生蟲、抑菌等活性[5]。

雙水相提取是一種新型的用于提取、分離、純化的技術，具有操作簡單、條件溫和、綠色環(huán)保等特點[6]。通過雙水相提取的天然產(chǎn)物可獲得較高的得率和純度，尤其適用于活性要求高、產(chǎn)物濃度高的天然產(chǎn)物的分離。目前，研究采用超聲波技術和微波技術與不同的雙水相體系聯(lián)合起來可快速、簡便、高效萃取制備植物多糖，巫永華等[7]利用超聲輔助雙水相（NH4）2SO4-聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）6000提取牛蒡多糖，LIN等[8]利用微波輔助雙水相（NH4）2SO4-乙醇提取香菇多糖，王鑫等[9]采用超聲波輔助異丙醇-硫酸銨雙水相體系分離甜玉米芯多糖，均取得了良好的效果。

目前，有關檳榔活性成分的研究主要集中于生物堿、多酚、單寧等方面，而多糖方面則鮮見報道；僅有唐敏敏等[10]采用響應面組合設計優(yōu)化超聲波輔助提取未成熟的檳榔籽多糖的工藝研究。超聲波輔助雙水相體系提取技術用于檳榔多糖的研究未見報道，本研究采用響應面優(yōu)化超聲輔助（NH4）2SO4-乙醇雙水相體系提取檳榔多糖的提取參數(shù)，優(yōu)化檳榔多糖的提取條件，并研究其體外抗氧化活性，以期為海南檳榔產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檳榔：湖南口味王集團有限責任公司；DPPH試劑、ABTS試劑：上海麥克林生化試劑有限公司；無水乙醇：成都市科隆化學品有限公司；雙氧水、過硫酸鉀、抗壞血酸：國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

KQ3200E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；R206旋轉蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司；Scientz-12N型真空冷凍干燥機：德國CHRIST公司；TU-1810紫外分光光度計：北京普析通用有限公司；L550離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雙水相體系的確定

本研究采用（NH4）2SO4-乙醇體系提取檳榔多糖，采用濁度滴定法確定雙水相系統(tǒng)圖，硫酸銨逐步加入一定體積的乙醇溶液中，記錄滴加量[11]。制備30%乙醇溶液600 mL備用，準確稱取硫酸銨100 g，按照硫酸銨比乙醇溶液為2∶1（g/mL）加入至30%乙醇中，在電磁攪拌器的作用下，快速溶解硫酸銨20 min，冷卻至25℃，可觀察到明顯的分層現(xiàn)象，上相為乙醇和水，下相為硫酸銨飽和溶液。

1.2.2 檳榔多糖提取率計算

按照苯酚-硫酸顯色法繪制葡萄糖標準曲線[12]，將100 mg/L葡萄糖標準溶液稀釋為不同濃度的待測液，于490 nm處測定溶液的吸光值，繪制以吸光值為縱坐標、葡萄糖濃度為橫坐標的標準曲線，得出的回歸方程為y=8.405 7x+0.004 1，R2=0.992 8，線性關系良好。試驗提取得到的檳榔多糖，加蒸餾水定容至100 mL，吸取1 mL稀釋液，采用苯酚-硫酸法進行測定；利用標準曲線回歸方程計算檳榔多糖含量。

1.2.3 超聲輔助雙水相體系提取檳榔多糖試驗設計

1.2.3.1 單因素試驗設計

1）不同料液比的提取試驗：（NH4）2SO4-乙醇雙水相體系組成質量為2∶1，固定超聲時間30 min，超聲溫度 60 ℃，考察料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）對檳榔多糖提取率的影響。

2）不同超聲時間的提取試驗：固定料液比 1∶30（g/mL），超聲溫度 60℃，考察超聲時間（10、20、30、40、50 min）對檳榔多糖提取率的影響。

3）不同超聲溫度的提取試驗：固定料液比1∶30（g/mL），固定超聲時間 30 min，考察超聲溫度 40、50、60、70、80℃對檳榔多糖提取率的影響。

1.2.3.2 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇超聲溫度、超聲時間、料液比為自變量，以多糖提取率為響應值，根據(jù)Box-Behnken設計原理，采用響應面分析法進行試驗設計，優(yōu)化超聲輔助雙水相提取檳榔多糖的工藝，因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Independent variables and their levels of response surface design

1.2.4 檳榔多糖體外抗氧化活性試驗

1.2.4.1 DPPH自由基清除試驗

根據(jù)Ji等[13]的方法，并稍作修改。用無水乙醇配制0.2 mol/L的DPPH溶液，吸取2 mL不同濃度的檳榔多糖溶液與2 mL DPPH溶液混勻，置于避光處靜置30 min，在517 nm處測吸光值，以VC作為陽性對照。按公式計算DPPH自由基清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（As-Ab）/Ac]×100

式中：As為2 mL樣品液與2 mL DPPH溶液的吸光值；Ab為添加2 mL檳榔多糖樣品與2 mL 50%乙醇的吸光值；Ac為2 mL去離子水和2 mL DPPH溶液的吸光值。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除試驗

參照李旭東等[14]的方法，略作修改。配制7.00mol/L的ABTS溶液與2.45 mol/L的過硫酸鉀溶液，將兩者等體積混合后，置于避光處靜置16 h，將其稀釋至732 nm處的吸光值為（0.7±0.02）。吸取400 μL不同濃度的樣品溶液，與3 mL稀釋好的ABTS溶液混勻，置于避光處靜置30 min，在732 nm處測吸光值，以VC作為陽性對照。按式計算ABTS+自由基清除率。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（As/A0）]×100

式中：As為樣品組的吸光值；A0為去離子水代替樣品的空白組吸光值。

1.2.4.3 羥基自由基清除試驗

參照Chen等[15]的方法，略作修改。取1 mL不同濃度的檳榔多糖溶液于試管中，向各管中加入2 mL硫酸亞鐵溶液（3 mmol/L）和1.5 mL水楊酸溶液（1.8 mmol/L）?；靹蚝?，加入0.03%雙氧水0.1 mL啟動反應，混勻。37℃水浴30 min，在波長510 nm下測定吸光值。以去離子水代替多糖溶液做空白，不同濃度的VC替代多糖樣品作為陽性對照。按公式計算羥基自由基清除率。

羥基自由基清除率/%=（A0-Aa）/A0×100

式中：A0為去離子水代替樣品的空白組吸光值；Aa為樣品組的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復試驗的平均值，并表示為平均值±標準差，單因素試驗數(shù)據(jù)運用Origin 7.0軟件繪制趨勢曲線圖；響應面試驗采用Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析，并優(yōu)化出最佳提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對檳榔多糖提取率的影響

料液比對檳榔多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對檳榔多糖提取率的影響Fig.1 Effects of material-to-solvent ratio on polysaccharide yield

由圖 1 可知，在料液比為 1∶10（g/mL）時，由于提取溶劑相對較少，溶液黏度較高而不利于植物多糖的擴散，多糖提取率較低；隨著提取溶劑含量的增加，細胞內外多糖濃度出現(xiàn)較大差異，內高外低，檳榔多糖不斷向外擴散，提取率顯著提高。隨著提取溶劑的進一步增大，在超聲作用下多糖的凝聚作用減弱，多糖開始部分降解，提取率出現(xiàn)下降趨勢，提取溶劑過多還會增加后期濃縮和醇沉的能耗與工作量，增加檳榔多糖的提取成本。因此，選擇料液比為1∶30（g/mL）進行響應面優(yōu)化。

2.1.2 超聲時間對檳榔多糖提取率的影響

超聲時間對檳榔多糖提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對檳榔多糖得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic power time on polysaccharide yield

由圖2可知，在10 min～30 min之間，檳榔多糖的提取率隨著超聲時間的延長快速升高，30 min之后多糖的提取率逐漸下降。這可能是在剛開始提取時，檳榔多糖沒有充分溶解在提取溶劑中；隨著超聲時間的延長，檳榔與提取溶劑接觸面積逐步變大，且超聲波的空穴效應促進檳榔多糖的快速傳遞，促使提取率快速上升[16]。但提取一定時間后，檳榔多糖基本溶出完全，提取率不再變化，較長時間的超聲處理，使得部分多糖糖苷鍵斷裂和降解，提取率出現(xiàn)一定的下降趨勢[17]。因此，選擇超聲時間為30 min進行響應面優(yōu)化。

2.1.3 超聲溫度對檳榔多糖提取率的影響

溫度過低時，分子運動速度較慢，植物多糖無法充分溶出；當溫度升高，分子運動速率加快，植物多糖溶解度增加[18]。超聲溫度對檳榔多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對檳榔多糖提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on polysaccharide yield

由圖3可知，檳榔多糖的提取率隨著超聲溫度的升高呈現(xiàn)先增加后略降低的趨勢。這是因為隨著超聲溫度的升高，使檳榔多糖溶出的速度加快，提取率顯著提高。但當超聲溫度過高時，檳榔多糖糖苷鍵結構遭到部分破壞，產(chǎn)生降解作用，檳榔多糖提取率出現(xiàn)略下降趨勢[19]。因此，選擇超聲溫度為60℃進行響應面優(yōu)化。

2.2 檳榔多糖提取工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 模型方程建立與顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對超聲溫度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）3個因素對檳榔多糖提取率（Y）為響應值進行試驗設計，得到的響應面試驗設計分析結果如表2所示（實測值為3次平行試驗結果的平均值），利用Design-Expert 8.0.6軟件分析處理試驗數(shù)據(jù)，可以得到回歸方程為Y=3.79-0.007A+0.12B+0.037C+0.20AB+0.007 5AC-0.32BC+0.26A2+0.019B2+0.074C2。

表2 響應面試驗設計及試驗結果Table 2 Experimental design and results of the response surface methodology

根據(jù)回歸模型方程進行方差分析結果見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations

由表3方差分析可以看出，該回歸模型P=0.038 4<0.05），說明回歸模型具有統(tǒng)計學差異，失擬項P=0.9821>0.05，差異不顯著，因此試驗中未知因素對試驗結果干擾較小，殘差均由隨機誤差所引起。該模型的相關系數(shù)R2=0.840 2，表明有84.02%的試驗值可用預測值來代替，說明該模型擬合度好，試驗誤差小，可以用于響應值的預測。根據(jù)F值可看出，影響因子的主效應主次順序為超聲時間>超聲溫度>料液比。交互項BC、二次項A2對試驗結果有影響（P<0.05），說明各工藝條件與提取率之間不是簡單的線性關系，而是一種非線性關系。綜上所述，該模型擬合度高，可用該回歸模型來描述各工藝參數(shù)與響應值之間的真實關系。

2.2.2 響應面交互作用影響結果

等高線圖、響應面圖可以直觀地反映兩因素之間的交互作用。響應面圖越陡說明兩自變量的交互作用對響應值影響程度越大；相反，越平緩交互作用影響越不顯著。等高線圖越偏離圓形，交互影響越強；反之，越接近圓形，交互影響越弱。通過Box-Behnken試驗得到的多元回歸模型所作的響應曲面圖見圖4。

圖4 各因素交互作用的響應面和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effects of different extraction parameters on the yield

從圖4可知，主次因素順序為超聲時間＞超聲溫度>料液比；且交互項BC作用顯著，這與方差結果一致。

2.2.3 最優(yōu)條件的確定與回歸模型的驗證

通過試驗分析，確定超聲輔助雙水相提取檳榔多糖的最佳提取工藝為當超聲溫度為69.54℃，超聲時間為 40.54 min，料液比為 1∶19.96（g/mL）時，此條件下檳榔多糖提取率為4.67%?？紤]到實際操作的簡便性和可行性，將提取條件調整為超聲溫度70℃，超聲時間為 40 min，料液比為 1∶20（g/mL），此工藝條件下進行超聲輔助雙水相提取檳榔多糖，試驗重復3次取平均值，得率為（4.52±0.25）%。結果與預測值誤差較小，表明優(yōu)化后的工藝條件準確可靠，具有一定的應用價值。

2.3 體外抗氧化試驗結果與分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

檳榔多糖的DPPH自由基清除能力見圖5。

圖5 檳榔多糖的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability of ACPs

由圖5可知，檳榔多糖及VC對DPPH自由基清除能力隨濃度增加而增強，并且呈現(xiàn)一定的劑量效應關系，在濃度為1.0 mg/mL時，檳榔多糖的DPPH自由基清除率達到35.14%，低于1.0 mg/mL VC91.75%的清除率；當檳榔多糖濃度為2.5 mg/mL時，自由基清除率達到50.86%，這高于蔡延渠等[20]提取的桃膠多糖的抗氧化能力。在本試驗測試的濃度范圍內，盡管檳榔多糖的DPPH自由基清除率不如VC強，但仍具有一定的清除能力，可作為天然抗氧化劑應用。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力

ABTS+·是一種穩(wěn)定的有機自由基，通過ABTS原液與過硫酸鉀在室溫（25℃）黑暗中反應12 h～16 h產(chǎn)生，在外來抗氧化劑存在的情況下，ABTS+·將會減少。通過測定反應液在732 nm波長處吸光值的變化，可得到植物多糖對ABTS+·的清除效果[21]。

由圖6可知，在濃度0～2.0 mg/mL范圍內，檳榔多糖和VC隨著溶液濃度的增加，對ABTS+自由基的清除率先增大后趨于穩(wěn)定，其中當濃度大于2.0 mg/mL檳榔多糖對ABTS+自由基的清除率趨于平緩，基本保持在40%左右。

圖6 檳榔多糖的ABTS+自由基清除能力Fig.6 ABTS+free radical scavenging ability of ACPs

2.3.3 羥基自由基清除能力

·OH是活性最強、毒性最大的自由基，可以與活細胞中分子發(fā)生反應造成損害，且反應速度快，被破壞的分子涉及糖類、氨基酸、磷脂、核苷和有機酸等[22]。檳榔多糖的對羥基自由基清除能力見圖7。

圖7 檳榔多糖對羥基自由基清除能力Fig.7·OH free radical scavenging ability of ACPs

由圖7可知，在濃度0～2.0 mg/mL范圍內，檳榔多糖隨著濃度的增加，·OH清除率逐漸增強；檳榔多糖溶液濃度從0.5 mg/mL增加到2.5 mg/mL，·OH的清除率從20.32%增加到46.86%。

3 結論

采用超聲輔助雙水相體系結合響應面優(yōu)化法建立了檳榔多糖提取率的二次多項式數(shù)學模型，在（NH4）2SO4乙醇的質量比為2∶1時，雙水相體系最佳；優(yōu)化出檳榔多糖提取的最佳工藝條件為料液比1∶20（g/mL），超聲溫度 70℃，超聲時間 40 min，檳榔多糖的提取率達到（4.52±0.25）%。3種體外抗氧化試驗的結果均顯示檳榔多糖具有較好的抗氧化活性，可作為潛在的天然抗氧化劑應用于功能性食品等領域，但檳榔多糖體內抗氧化活性的相關機制有待于進一步研究。