黃珊，劉嘉，李貴華，劉永翔，3，盧揚，劉輝，黃畢應，李俊*

（1.貴州省農業(yè)科學院食品加工研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州省福泉市牛場鎮(zhèn)人民政府，貴州 黔南 550508；3.貴州省生物技術重點實驗室，貴州 貴陽 550006）

竹葉在我國擁有悠久的食用和藥用歷史，是國家認可并批準的藥食兩用植物[1]。古人對竹葉研究頗多，在食用方面，竹葉茶、竹葉酒等產品已有數百年歷史。藥用方面，古醫(yī)書中關于竹葉的記載很多?！端幮哉摗分杏涊d竹葉主吐血熱毒風，止消渴；《食療本草》中記載竹葉主咳逆、消渴、痰飲、喉痹、除煩熱；《本草綱目》中記載竹葉煎濃汁，漱齒中出血，洗脫肛不收[2]?，F(xiàn)代研究表明，竹葉中含有黃酮及其甙類、活性多糖及其衍生物等活性物質，富含錳、鋅、硒、鍺、硅等多種能活化人體細胞的元素，以及醛、醇為主的芳香成分等[3-4]。

竹葉黃酮主要是碳苷黃酮，包括葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷4類[5]。天然來源黃酮具有抑菌、抗氧化、解毒、抗光敏及增強免疫力等作用[6-7]。因具有清除皮膚中自由基、避免細胞損傷、促進皮膚新陳代謝、提升皮膚彈性、減少色素沉著等功效，從而可以達到美白效果[7-9]。現(xiàn)階段關于竹葉中黃酮的提取方法主要有溶劑提取法（水、乙醇、甲醇、丙酮等）、微波或超聲波輔助提取法、超臨界CO2萃取法、酶提取法等[9]。王紫薇等[10]利用超聲波輔助乙醇提取淡竹葉中的黃酮類物質，提取率為2.11%。史娟等[11]采用超聲波預處理-乙醇回流法提取漢中毛竹葉黃酮類物質，提取率最高為2.92%。王文淵等[12]采用纖維素酶輔助提取竹葉中黃酮，提取率可達4.21%。

方竹[Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino]筍肉質地脆嫩，味道鮮美，受到廣大消費者歡迎。近年來方竹在貴州省內的種植面積不斷增加，但關于方竹葉加工和方竹葉黃酮提取利用的研究較少。本研究以方竹葉為原料，通過對比乙醇提取法、纖維素酶提取法、超聲輔助乙醇提取法、振蕩輔助乙醇提取法4種不同提取方式對方竹葉黃酮提取率的影響，對比4種提取方式所得黃酮體外抗氧化能力，確定最優(yōu)的方竹葉黃酮提取工藝，為方竹葉的進一步開發(fā)利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

方竹葉：貴州省林業(yè)科學研究院提供，在60℃烘箱中烘干 10 h，使含水量達到（12.0±0.5）%；蘆丁標準品（≥98%）、纖維素酶（3 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硝酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鋁、三氯化鐵、三氯醋酸、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

UV-6000型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；G-040s型超聲波清洗機：深圳市歌能清洗設備有限公司；HHS型數顯恒溫水浴鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；HS-7型磁力攪拌器：德國IKA公司。

1.2 方竹葉黃酮提取方法

1.2.1 乙醇提取法

稱取粉碎后的方竹葉粉1.0 g，按照如下條件確定乙醇提取法較優(yōu)工藝條件。1）固定乙醇濃度70%，設定料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）。2）固定料液比為 1∶25（g/mL），設定乙醇濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。制作好的樣品在室溫（25℃）條件下用磁力攪拌器攪拌提取60 min，用濾紙過濾，測定濾液中的黃酮含量，計算黃酮提取率。

1.2.2 纖維素酶提取法

稱取粉碎后的方竹葉粉1.0 g，按照如下條件確定纖維素酶提取法較優(yōu)工藝條件。1）固定纖維素酶添加量0.6%，設定料液比為 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）。2）固定料液比為 1∶25（g/mL），設定纖維素酶添加量為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。后續(xù)步驟同1.2.1。

1.2.3 超聲輔助乙醇提取法

1.2.3.1 單因素試驗

根據1.2.1中確定的較優(yōu)乙醇提取工藝參數，分別考察超聲時間、超聲功率、超聲溫度對方竹葉黃酮提取率的影響。設置超聲輔助乙醇提取的單因素試驗條件如下。

1）固定超聲溫度40℃，超聲功率40 W，設定超聲時間為 20、40、60、80、100、120 min。

2）固定超聲溫度40℃，超聲時間100 min，設定超聲功率為 20、40、60、80、100 W。

3）固定超聲功率40 W，超聲時間100 min，設定超聲溫度為 30、35、40、45、50、55、60 ℃。

1.2.3.2 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇A超聲時間、B超聲溫度、C超聲功率進行響應面優(yōu)化試驗，優(yōu)化超聲輔助乙醇提取方竹葉黃酮的提取工藝。響應面因素水平見表1。

表1 響應面優(yōu)化因素水平Table 1 Factors and levels of the response surface optimization

1.2.4 振蕩輔助乙醇提取法

1.2.4.1 單因素試驗

根據1.2.1中確定的較優(yōu)乙醇提取工藝參數，分別考察振蕩時間、振蕩溫度、振蕩頻率對方竹葉黃酮提取率的影響。設置振蕩輔助乙醇提取的單因素試驗條件如下。

1）固定振蕩溫度40℃，振蕩頻率150 r/min，設定振蕩時間為 30、60、90、120、150、180 min。

2）固定振蕩溫度40℃，振蕩時間120 min，設定振蕩頻率為 100、150、200、250、300 r/min。

3）固定振蕩頻率150 r/min，振蕩時間120 min，設定振蕩溫度為 30、35、40、45、50、55、60 ℃。

1.2.4.2 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇E振蕩時間、F振蕩溫度、G振蕩頻率進行響應面優(yōu)化試驗，優(yōu)化振蕩輔助乙醇提取方竹葉黃酮的提取工藝。響應面因素水平見表2。

表2 響應面優(yōu)化因素水平Table 2 Factors and levels of the response surface optimization

1.3 黃酮含量及提取率測定

用30%乙醇配制0.2 mg/mL蘆丁標準溶液，分別移取 0、1、2、3、4、5 mL 上述蘆丁標準溶液，依次加入到25 mL容量瓶中，用30%乙醇稀釋至12.5 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻并靜置5 min；然后加入1 mL 10%硝酸鋁，搖勻并靜置6 min；最后加入10 mL 1 mol/mL氫氧化鈉，用30%乙醇定容至刻度，搖勻后置于80℃水浴鍋中水浴加熱10 min，以空白溶液作為對照，在510 nm處測定樣品溶液吸光值[13]。以蘆丁標準溶液濃度為橫坐標x，吸光值為縱坐標y，制作標準曲線為y=1.754x-0.005 1，r2=0.999 1。取方竹葉提取液1 mL，按照上述步驟操作，所有樣品平行測定3次，取A510的平均值，代入標準曲線計算相應的黃酮含量。

方竹葉黃酮提取率按如下公式計算。

式中：W為方竹葉黃酮提取率，%；W1為方竹葉提取液中的黃酮質量，g；W2為方竹葉粉末質量，g。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH自由基清除率測定

配制79 mg/L的DPPH-乙醇溶液，低溫避光保存?zhèn)溆?。?.2中不同提取方法得到的方竹葉黃酮提取液用乙醇溶液配制成質量濃度分別為200、400、600、800、1 000 μg/mL的溶液。分別取0.5 mL不同質量濃度的樣液，加入5.0 mL DPPH-乙醇溶液，搖勻后置于37℃水浴中反應1 h，以乙醇為空白對照（A空白），在波長為517 nm處測定樣品溶液吸光值（A樣品）[14-15]，DPPH自由基清除率按如下公式計算。

1.4.2 還原力測定

取2.5 mL的磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 1%鐵氰化鉀混勻，分別移取1 mL 1.2中4種不同提取方法所得不同質量濃度的黃酮提取液加入反應體系內，搖勻后置于50℃水浴中20 min。流水快速冷卻，然后分別加入2.5 mL 10%三氯醋酸終止反應，3 000 r/min離心10 min，離心后取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，搖勻后靜置10 min，在波長700 nm處測定樣品溶液吸光值[16-17]。

1.5 數據處理

采用Origin（Version 8.6）作圖，Design-Expert（Version 8.0）進行響應面分析，SPSS（Version 17.0）進行統(tǒng)計學分析，p<0.05認為有統(tǒng)計學顯著性差異，p<0.01認為有統(tǒng)計學極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 乙醇提取工藝優(yōu)化結果

不同料液比和乙醇濃度對方竹葉黃酮提取率的影響結果見圖1。

圖1 不同料液比和乙醇濃度對方竹葉黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio and ethanol concenration on the extraction rate of flavonoids from Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino leaves

由圖 1A 可知，料液比由 1∶10（g/mL）變化到 1∶25（g/mL），黃酮提取率顯著升高（p<0.05），在料液比為1∶25（g/mL）時達到最大值（2.07%），之后黃酮提取率隨提取溶劑增加顯著下降（p＜0.05）。當提取溶劑較少時，原料浸潤不完全，從而導致提取率較低；而溶劑過多則會增加提取能耗，在同等提取能耗條件下黃酮類物質提取不充分導致提取率降低，且溶劑過多會造成資源浪費[18]。由圖1B可知，隨著乙醇濃度增加，黃酮提取率呈先顯著升高后顯著下降的趨勢（p＜0.05），在乙醇濃度為80%時黃酮提取率達到最大值（2.41%）。張春娟[19]研究表明，方竹葉黃酮主要為葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷4種黃酮碳苷，易溶于70%～80%的乙醇溶液，當乙醇濃度超過80%時，某些醇溶性雜質、色素等成分溶出量增加，與4種黃酮碳苷競爭乙醇溶液結合部位，導致黃酮提取率下降。綜上所述，方竹葉黃酮乙醇提取工藝較優(yōu)的料液比為1∶25（g/mL），較優(yōu)的乙醇濃度為80%。

2.2 纖維素酶提取工藝優(yōu)化結果

不同料液比和纖維素酶添加量對方竹葉黃酮提取率的影響結果見圖2。

圖2 不同料液比和纖維素酶添加量對方竹葉黃酮提取率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio and cellulase addition amount on the extraction rate of flavonoids from Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino leaves

由圖2A可知，隨著溶劑增加，黃酮提取率顯著升高（p＜0.05），在料液比為 1∶25（g/mL）時達到最大值（1.51%），之后隨著溶劑增加顯著下降（p＜0.05）。由圖2B可知，隨著纖維素酶添加量增加，黃酮提取率顯著升高（p＜0.05），在纖維素酶添加量為0.4%時黃酮提取率達到最大值（1.51%），之后隨著纖維素酶添加量繼續(xù)升高，黃酮提取率基本保持不變。纖維素酶能夠破壞方竹葉細胞壁，使黃酮類物質溶出，當纖維素酶添加量較少時，酶與底物充分接觸，黃酮提取率升高；當纖維素酶添加過量時，底物不足，所以黃酮提取率基本保持不變[20-21]。綜上所述，方竹葉黃酮纖維素酶提取工藝較優(yōu)的料液比為1∶25（g/mL），較優(yōu)的纖維素酶添加量為0.4%。

2.3 超聲輔助乙醇提取工藝優(yōu)化結果

2.3.1 單因素試驗結果

超聲時間、超聲溫度和超聲功率對方竹葉黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時間、超聲溫度和超聲功率對方竹葉黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time，ultrasonic temperature and ultrasonic power on the extraction rate of flavonoids from Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino leaves

由圖3A可知，隨著超聲時間延長，黃酮提取率顯著升高（p<0.05），在超聲時間為100 min時達到2.76%，之后隨著超聲時間繼續(xù)延長黃酮提取率變化不顯著。由圖3B可知，超聲溫度在55℃時提取率最高（3.30%），超聲溫度過高或過低都會造成提取率降低。溫度升高會加速方竹葉中黃酮類物質溶出，但過高的溫度會造成方竹葉中活性成分被破壞，從而導致提取率降低[22-23]。由圖3C可知，增大超聲功率會使黃酮提取率顯著升高（p<0.05），在超聲功率為80 W時，黃酮提取率達到3.02%，之后隨著超聲功率繼續(xù)增大提取率變化不顯著。綜上所述，超聲輔助乙醇提取法較優(yōu)的提取工藝條件為超聲時間100 min，超聲溫度55℃，超聲功率80 W。

2.3.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.3.2.1 響應面優(yōu)化設計與結果

以Box-Behnken中心組合設計原則，選取超聲時間（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）為自變量，以黃酮提取率為響應值，設計三因素三水平響應面試驗優(yōu)化超聲輔助乙醇提取工藝，試驗方案及結果如表3所示。

表3 響應面優(yōu)化試驗方案及結果Table 3 Experimental scheme and results of response surface optimization

2.3.2.2 回歸方程與顯著性分析

利用Design-Expert 8.0軟件對表3試驗數據進行二次多項式逐步回歸擬合，得回歸模型方程為Y=4.01+0.21A+0.05B+0.08C+0.01AB+0.03AC+0.07BC-0.10A2-0.31B2-0.18C2。

回歸模型方差分析見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of items of regression equation

由表4可知，模型F值為78.23，模型差異極顯著（p<0.01），失擬項 F 值為 0.30（p>0.05），結果表明該模型可以對超聲波輔助乙醇提取法工藝條件進行預測和分析。R2=0.990 2，說明黃酮提取率的變化有99.02%來源于超聲時間、超聲溫度和超聲功率的影響。方差分析結果中 A、C、BC、A2、B2、C2各項差異均極顯著（p<0.01），一次項B差異顯著（p<0.05）。3個因素對黃酮提取率具有交互影響，其影響大小依次為A>C>B。

回歸模型預測得到超聲輔助乙醇提取最優(yōu)工藝條件為超聲時間112.2 min，超聲溫度56.8℃，超聲功率85.2 W。在此條件下黃酮提取率的預測值為4.10%，考慮到實際操作的可行性，將最優(yōu)提取工藝修正為超聲時間112 min，超聲溫度57℃，超聲功率85 W。在該條件下測定黃酮提取率的平均值為（4.05±0.03）%，與預測值基本一致。該模型可以較好地反映最優(yōu)的超聲輔助乙醇提取工藝條件。

2.4 振蕩輔助乙醇提取法優(yōu)化結果

2.4.1 單因素試驗結果

振蕩時間、振蕩溫度和振蕩頻率對方竹葉黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 振蕩時間、振蕩溫度和振蕩頻率對方竹葉黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of oscillation time，oscillation temperature and oscillation frequency on the extraction rate of flavonoids from Chimonobambusa quadrangularis（Fenzi）Makino leaves

由圖4A可知，隨著振蕩時間延長，黃酮提取率顯著升高（p<0.05），在振蕩時間為120 min時達到2.52%，之后隨著振蕩時間延長黃酮提取率變化不顯著（p>0.05）。由圖4B可知，隨著振蕩溫度升高，黃酮提取率顯著升高（p<0.05），在溫度為55℃時提取率達到最大值（3.04%），當振蕩溫度超過55℃時提取率顯著降低（p<0.05）。由圖4C可知，黃酮提取率隨振蕩頻率增加顯著升高（p<0.05），在振蕩頻率為250 r/min時，黃酮提取率達到2.76%，之后黃酮提取率隨著振蕩頻率增加變化不顯著。綜上所述，振蕩輔助乙醇提取法較優(yōu)的提取工藝條件為振蕩時間120 min，振蕩溫度55℃，振蕩頻率250 r/min。

2.4.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.4.2.1 響應面優(yōu)化設計與結果

根據單因素試驗結果，以Box-Behnken中心組合設計原則，選取E振蕩時間、F振蕩溫度、G振蕩頻率為自變量，以黃酮提取率為響應值，設計三因素三水平響應面試驗優(yōu)化振蕩輔助乙醇提取工藝，試驗方案及結果如表5所示。

表5 響應面優(yōu)化試驗方案及結果Table 5 Experimental scheme and results of response surface optimization

2.4.2.2 回歸方程與顯著性分析

利用Design-Expert 8.0軟件對表5試驗數據進行二次多項式逐步回歸擬合，得回歸模型方程為Y=3.77+0.14E+0.02F+0.14G+0.03EF+0.04EG+0.09FG-0.14E2-0.22F2-0.16G2。

回歸模型方差分析見表6。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of items of regression equation

由表6可知，模型F值為90.92，差異極顯著（p<0.01），失擬項F值為0.49（p>0.05），從而該模型可以對振蕩輔助乙醇提取法工藝條件進行預測和分析。R2=0.991 5，說明黃酮提取率的變化有99.15%來源于振蕩時間、振蕩溫度和振蕩頻率的影響。方差分析結果中E、G、FG、E2、F2、G2各項差異均極顯著（p<0.01），交互項EG差異顯著（p<0.05），3個因素對黃酮提取率具有交互影響，其影響大小依次為E>G>F。

回歸模型預測得到振蕩輔助乙醇提取最優(yōu)工藝條件為振蕩時間150.0 min，振蕩溫度56.6℃，振蕩頻率273.6 r/min。在此條件下黃酮提取率的預測值為3.82%，考慮到實際操作的可行性，將最優(yōu)提取工藝修正為振蕩時間150 min，振蕩溫度57℃，振蕩頻率274 r/min。在該條件下測定黃酮提取率的平均值為（3.76±0.05）%，與預測值基本一致。該模型可以很好地反映最優(yōu)的振蕩輔助乙醇提取法工藝條件。

2.5 不同提取方法提取率和抗氧化能力對比

不同提取方法提取率及不同濃度下DPPH自由基清除能力和Fe3+還原能力對比見圖5。

圖5 不同提取方法提取率及不同提取液清除DPPH自由基能力和Fe3+還原能力對比Fig.5 Extraction rate of different extraction methods and DPPH radical scavenging capacity of different extracts and Fe3+reduction ability

由圖5A可知，超聲輔助乙醇提取法所得方竹葉黃酮提取率為（4.06±0.06）%，顯著高于其它3種方法（p<0.05）。由圖5B可知，隨著質量濃度的增加，4種提取方法提取的方竹葉黃酮DPPH自由基清除率逐漸增強，表明其抗氧化能力逐漸增強。在超聲輔助乙醇處理下，提取的方竹葉黃酮在不同質量濃度下DPPH自由基清除率都是最高的，其抗氧化能力也最強。由圖5C可知，4種提取方法下方竹葉黃酮Fe3+還原力同樣隨著質量濃度的增加而增強。在超聲輔助乙醇處理下，方竹葉黃酮Fe3+還原能力強于其它提取方式。綜上所述，超聲輔助乙醇提取法黃酮提取率高，提取到的黃酮抗氧化能力強，因此選擇超聲輔助乙醇提取法為最優(yōu)的方竹葉黃酮提取方法。

3 結論

以方竹葉為原料，通過對比乙醇提取、纖維素酶提取、振蕩輔助乙醇提取、超聲輔助乙醇提取4種不同提取方式對方竹葉黃酮提取率的影響，比較4種提取方式所得提取物體外抗氧化活性，確定了最優(yōu)的方竹葉黃酮提取工藝。通過對不同提取方法得到的黃酮提取率進行比較，結果表明超聲輔助乙醇提取法黃酮提取率最高，為（4.06±0.06）%，最優(yōu)工藝條件為超聲時間112 min，超聲溫度57℃，超聲功率85 W。隨著質量濃度的增加，不同提取方法所得提取物的DPPH自由基清除率和Fe3+還原力均逐漸增強，超聲輔助乙醇提取法所得提取物的DPPH自由基清除能力和還原力最強。對比黃酮提取率和抗氧化活性，確定最優(yōu)的方竹葉黃酮提取方法為超聲輔助乙醇提取法。該方法黃酮提取率高、便于操作、應用成本較低，為方竹葉資源的開發(fā)利用提供技術支撐。