桂利利，吳正坤，余惠凡，李飛

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院，湖北 十堰 442000）

黃藥（Premna cavaleriei Levl.）是馬鞭草科豆腐柴屬植物[1]，湖北省十堰市武當(dāng)山地區(qū)野生黃藥分布廣、品質(zhì)優(yōu)，當(dāng)?shù)鼐用裼杏命S藥葉制作“神仙豆腐”的傳統(tǒng)，但多以農(nóng)家自制為主，缺乏系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化開(kāi)發(fā)。目前尚無(wú)黃藥的相關(guān)研究報(bào)道，而相對(duì)報(bào)道較多的為黃藥同屬植物。研究表明，該屬植物的葉中含有黃酮、果膠、揮發(fā)油、氨基酸、維生素、多糖和礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分[2-3]，其中黃酮類化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、防治心腦血管疾病及降血脂等功效，應(yīng)用范圍廣[4-6]。因此，深入研究黃藥葉黃酮成分、提取工藝等可為當(dāng)?shù)攸S藥葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定與產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

本文以總黃酮得率為檢測(cè)指標(biāo)，乙醇為提取溶劑，選用L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化黃藥葉總黃酮超聲波輔助提取工藝，并通過(guò)測(cè)定羥自由基清除率、DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和鐵離子還原能力考察其體外抗氧化活性。本研究彌補(bǔ)了黃藥研究的空白，為明確其有效成分奠定基礎(chǔ)，并為黃藥藥食同源相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃藥葉原料：2019年9月采于十堰市張灣區(qū)黃龍鎮(zhèn)青石村，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院中藥學(xué)專家張曉燕副教授鑒定為馬鞭草科豆腐柴屬植物黃藥（Premna cavaleriei Levl.）的葉；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鄰苯三酚、水楊酸、氯化鐵、亞硝酸鈉、硝酸鋁、L-抗壞血酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；30%過(guò)氧化氫（優(yōu)級(jí)純）：德國(guó)Merck公司；鹽酸（分析純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；DPPH、三羥甲基氨基甲烷（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；2，4，6-三吡啶基三嗪（2，4，6-tripyridyl-triazine，TPTZ）（分析純）：阿拉丁試劑有限公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-250DE型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；MBF-20A型高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市邁邦機(jī)械設(shè)備有限公司；CPA225D型電子天平、PB-10型酸度計(jì)：德國(guó)Sartorius公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SH2-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵：河南省予華儀器有限公司；GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃藥葉樣品制備

新鮮黃藥葉，采摘當(dāng)天用純水洗凈，50℃烘干，粉碎過(guò)60目篩，得黃藥葉粉末，密封備用。

1.2.2 超聲波輔助提取法提取黃藥葉總黃酮

1.2.2.1 單因素試驗(yàn)

精密稱取1.2.1項(xiàng)下樣品2.000 g，確定料液比1∶20（g/mL），60%乙醇溶液，浸泡時(shí)間 30 min，提取溫度55℃，超聲功率125 W，提取時(shí)間30 min，提取次數(shù)1次為固定因子，分別考察提取溫度（25、35、45、55、65、75 ℃）、料液比[1∶7.5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL）]、乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%）、浸泡時(shí)間（0、10、20、30、40、50，60 min）、超聲功率（100、125、150、175、200、225、250 W）、提取時(shí)間（0、10、20、30、40、50、60 min） 和提取次數(shù)（1、2、3、4、5次）對(duì)超聲波輔助提取黃藥葉總黃酮得率的影響。

1.2.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇對(duì)總黃酮得率影響較大的4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.3 樣品提取液中總黃酮含量及得率測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取蘆丁對(duì)照品20.0 mg，加無(wú)水乙醇定容至50 mL，備用。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉光度法測(cè)定樣品總黃酮含量[7]。精密吸取對(duì)照品溶液 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于 25 mL 容量瓶中，加無(wú)水乙醇至6.0 mL，再分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min；加入1 mol/L氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，最后加入30%乙醇至刻度，放置15 min。510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)、蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.013 76X-0.001 04，R2=0.999 9，結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品在0～0.08 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3.3 樣品提取液中總黃酮含量及得率測(cè)定

依據(jù)1.2.2項(xiàng)下方法提取樣品，離心取上清，并用60%乙醇溶液定容至100 mL，精密吸取1.0mL至25mL容量瓶，待測(cè)，以等體積無(wú)水乙醇為對(duì)照，按1.2.3.2項(xiàng)下試驗(yàn)步驟進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。由公式（1）計(jì)算總黃酮得率。

式中：c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品中總黃酮含量，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品提取液總體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 黃藥葉總黃酮提取物抗氧化性能測(cè)定

1.2.4.1 羥自由基清除率測(cè)定

參考李亞軍等[8]和Liang等[9]的方法略作改動(dòng)。在最優(yōu)工藝條件下提取黃藥葉總黃酮，并用提取溶劑（即80%乙醇溶液）將提取液稀釋成濃度為50、100、200、300、400 μg/mL的黃藥葉總黃酮溶液，取樣品液1.0 mL于具塞刻度試管中，再加9 mmol/L FeSO41 mL，反應(yīng)15 min后加9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，最后加 8.8 mmol/L H2O21 mL，37℃反應(yīng) 30 min，測(cè)510 nm處吸光度值，記A1；用蒸餾水代替H2O2測(cè)定樣品的本底吸光度值，記A2；以蒸餾水代替樣品，記A0；用提取溶劑溶解陽(yáng)性對(duì)照物L(fēng)-抗壞血酸，并配制為上述濃度梯度的溶液，同法測(cè)定其羥自由基清除率。由公式（2）計(jì)算清除率。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

參考 Yeo等[10]和 GB/T 39100—2020《多肽抗氧化性測(cè)定DPPH和ABTS法》[11]的方法略有改動(dòng)。同1.2.4.1 方法，稀釋提取液得到濃度為 2、4、6、8、10、20、40 μg/mL的黃藥葉總黃酮溶液，取樣品液2.0 mL于具塞刻度試管中，再依次加2 mL的DPPH試劑（0.2 mmol/L），暗反應(yīng)30 min，離心后取上清液作為試驗(yàn)組，于517 nm處測(cè)吸光度值，記A1；用2.0 mL甲醇代替2.0 mL DPPH，測(cè)定樣品的本底吸光度值，記A2；用蒸餾水代替樣品作空白對(duì)照，記A0；用提取溶劑溶解陽(yáng)性對(duì)照物L(fēng)-抗壞血酸，并配制為上述濃度梯度的溶液，同法測(cè)定其DPPH自由基清除率。由公式（3）計(jì)算清除率。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

參考Tao等[12]的方法略有改動(dòng)。同1.2.4.1方法，稀釋提取液得到濃度為 10、20、30、40、50 μg/mL 的黃藥葉總黃酮溶液，取樣品液1.0 mL于具塞刻度試管中，再分別加 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）3 mL，37℃水浴20 min，立即加37℃預(yù)熱的7 mmol/L鄰苯三酚1 mL，迅速搖勻倒入比色皿，325 nm處每30 s測(cè)吸光度值，連測(cè)4 min，計(jì)算每分鐘變化值，記A1；蒸餾水代替樣品，增加值記A0；用提取溶劑溶解陽(yáng)性對(duì)照物L(fēng)-抗壞血酸，并配制為上述濃度梯度的溶液，同法測(cè)定其超氧陰離子自由基清除率。由公式（4）計(jì)算清除率。

1.2.4.4 鐵離子還原能力測(cè)定

參考王國(guó)慶等[13]的方法略有改動(dòng)。配制TPTZ工作液：將 0.3 mol/L 醋酸緩沖液（pH 3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L氯化鐵溶液以10∶1∶1 體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

同1.2.4.1方法，稀釋提取液得到濃度為25、50、100、200、300、400 μg/mL 的黃藥葉總黃酮溶液。試驗(yàn)組加入200 μL同濃度樣品和1.8 mL TPTZ工作液，空白組加入200 μL蒸餾水與1.8 mL TPTZ工作液，對(duì)照組加入200 μL不同濃度樣品和1.8 mL蒸餾水。避光靜置10 min，593 nm處測(cè)吸光度，空白組吸光度值為A0，試驗(yàn)組吸光度值為A1，對(duì)照組吸光度值為A2。用提取溶劑溶解陽(yáng)性對(duì)照物L(fēng)-抗壞血酸，并配制為上述濃度梯度的溶液，同法測(cè)定其鐵離子還原能力。吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)。由公式（5）計(jì)算鐵離子還原能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、GraphPad Prism 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取法單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取溫度對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取溫度對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.1 Extraction temperature on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖1可知，提取溫度在25℃～55℃時(shí)，總黃酮得率呈先下降后升高趨勢(shì)，在55℃時(shí)，達(dá)到峰值4.08%，繼續(xù)升溫至65℃以上時(shí)，總黃酮得率有所降低。溫度升高可加劇分子熱運(yùn)動(dòng)，降低溶劑黏度，總黃酮在溶劑中溶解速度加快，得率上升[14-15]；但溫度過(guò)高可能會(huì)加快溶劑揮發(fā)和總黃酮氧化分解，導(dǎo)致得率下降[16]。因此，55℃為最佳提取溫度。

2.1.2 料液比單因素試驗(yàn)結(jié)果

料液比對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖 2 可知，料液比在 1∶7.5（g/mL）～1∶30（g/mL）時(shí)，隨著溶劑體積的增大，總黃酮得率呈遞增趨勢(shì)，料液比為1∶30（g/mL）時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大值3.99%后趨于平衡。原因可能是隨著溶劑量的加大，樣品與溶劑的接觸面積也逐漸增大，在料液比1∶30（g/mL）時(shí)溶劑充分包裹樣品，再繼續(xù)增加溶劑量，對(duì)總黃酮得率將無(wú)促進(jìn)作用[17]。此外，隨溶劑量增大，細(xì)胞內(nèi)非黃酮類雜質(zhì)溶出量增加，阻礙了總黃酮溶出，導(dǎo)致得率下降[18]。為獲取最佳料液比，選取 1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中料液比的3個(gè)水平。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃藥葉總黃酮得率最高，為3.47%，但隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，總黃酮得率呈下降趨勢(shì)?？赡芤?0%乙醇溶液極性與黃藥葉中黃酮類化合物的極性較為相近，依據(jù)相似相溶原理，得率較高，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%時(shí)，提取溶劑與黃酮類化合物之間極性差異增大，導(dǎo)致總黃酮得率呈下降趨勢(shì)[19]。另外，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，更多的蛋白質(zhì)、糖類和脂溶性雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致總黃酮得率有所下降[20-21]。因此，選擇50%、60%和70%作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的3個(gè)水平。

2.1.4 浸泡時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

浸泡時(shí)間對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of soaking time the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖4可知，當(dāng)浸泡時(shí)間為10 min時(shí)，黃藥葉總黃酮得率最高，為2.98%。浸泡時(shí)間增加至20 min時(shí)，總黃酮得率有所下降，隨著浸泡時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，總黃酮得率基本穩(wěn)定。可能是因?yàn)槌跏茧A段提取溶劑迅速包裹樣品，提取液中黃酮類化合物含量提高[22]，但隨著浸泡時(shí)間的增加，樣品在提取液中逐漸沉降[23]，導(dǎo)致提取液中有效成分減少。因此，浸泡時(shí)間10 min為最佳。

2.1.5 超聲功率單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲功率對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 超聲功率對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖5可知，黃藥葉總黃酮得率隨著超聲功率的增加先升高后趨于平穩(wěn)，當(dāng)超聲功率150 W時(shí)，黃藥葉總黃酮得率最高，為3.82%。隨著超聲功率增強(qiáng)，加大了超聲波的“機(jī)械效應(yīng)”和“空化效應(yīng)”，可有效減小粉末與溶劑之間的阻滯層，提高樣品的破碎度，增加了總黃酮得率[24-25]；當(dāng)超聲功率達(dá)到一定值時(shí)，超聲波產(chǎn)生的“機(jī)械效應(yīng)”和“空化效應(yīng)”已達(dá)最佳，所以在150 W～250 W范圍，黃藥葉總黃酮得率基本保持恒定。因此，適宜超聲功率為150 W。

2.1.6 提取時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取時(shí)間對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 提取時(shí)間對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of extraction time on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖6可知，提取時(shí)間為30 min時(shí)，黃藥葉總黃酮得率達(dá)到峰值3.58%，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，總黃酮得率呈下降趨勢(shì)?？赡苡捎谔崛r(shí)間在0～30 min時(shí)，樣品破碎程度迅速增加，黃酮類化合物不斷溶出，提取液中總黃酮得率在30 min時(shí)達(dá)到最大值，但隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，部分總黃酮被氧化或分解，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物得率降低[26]。因此，選擇提取時(shí)間為20、30、40 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.7 提取次數(shù)單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取次數(shù)對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 提取次數(shù)對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of extraction times on the yield of total flavonoids in Premna cavaleriei Levl.leaves

由圖7可知，隨著提取次數(shù)增加，黃藥葉總黃酮得率先快速升高后緩慢升高。提取1次～3次時(shí)，總黃酮得率由2.82%快速增至4.19%，提取3次與提取1次相比，總黃酮得率增加48.58%。隨著提取次數(shù)進(jìn)一步增加，提取5次時(shí)總黃酮得率為4.74%，與提取3次相比，總黃酮得率增加13.13%。可能因每次更換溶劑進(jìn)行提取時(shí)，不斷形成高滲透壓環(huán)境，使得樣品中黃酮類化合物逐次被提取，而樣品中黃酮類化合物含量有限，隨著提取次數(shù)進(jìn)一步增加，黃酮類化合物已基本溶出，總黃酮得率增加緩慢；同時(shí)隨著提取次數(shù)增加，促進(jìn)了雜質(zhì)的溶出，影響了總黃酮的提取[27]。因此，選擇提取次數(shù)2、3、4次進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波輔助提取法提取工藝

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）4個(gè)因素，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)。其它參數(shù)固定為浸泡時(shí)間10 min，超聲功率150 W，提取溫度55℃，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Experimental results and analyses for optimization of total flavonoids

由表2可知，4個(gè)因素極差順序?yàn)镈＞B＞A＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃藥葉總黃酮得率影響最大，其次是提取時(shí)間、料液比，最后是提取次數(shù)。通過(guò)比較k值可知，4個(gè)因素的最佳水平為A2B3C2D3，即料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間 40 min，提取次數(shù) 3次，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，由于該條件不在正交試驗(yàn)的9次試驗(yàn)中，因此需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.2.2 方差分析及最優(yōu)工藝試驗(yàn)驗(yàn)證

方差分析見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiment results for optimization of total flavonoid extraction

由表3可知，上述4個(gè)因素對(duì)黃藥葉總黃酮得率的影響大小順序是乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間＞料液比＞提取次數(shù)，與極差分析結(jié)果一致。同時(shí)，由P值可知4個(gè)因素均對(duì)黃藥葉總黃酮得率有顯著影響。

為進(jìn)一步驗(yàn)證最優(yōu)工藝可靠性，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證，得率為分別為6.30%、6.25%和6.00%，均值為6.18%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13%，驗(yàn)證試驗(yàn)總黃酮得率均高于正交表中得率，證實(shí)該正交試驗(yàn)結(jié)果可靠，故確定黃藥葉總黃酮的最優(yōu)提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取次數(shù) 3 次，提取時(shí)間 40 min，料液比 1∶30（g/mL）。

2.3 黃藥葉總黃酮提取物抗氧化能力測(cè)定

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸抗氧化活性試驗(yàn)線性擬合結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 黃藥葉總黃酮提取物抗氧化活性試驗(yàn)線性擬合結(jié)果Table 4 The linearity correlation results of antioxidant activity of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves

表5 L-抗壞血酸抗氧化活性試驗(yàn)線性擬合結(jié)果Table 5 The linearity correlation results of antioxidant activity of L-ascorbic acid

2.3.1 羥自由基清除率測(cè)定

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除作用見(jiàn)圖8。

圖8 黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除作用Fig.8 Hlydroxyl radicals scavenging effects of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves and L-ascorbic acid

由圖 8 可知，在 50 μg/mL～500 μg/mL 范圍內(nèi)黃藥葉總黃酮提取物清除羥自由基的能力弱于同濃度的L-抗壞血酸，兩者對(duì)羥自由基的清除作用均隨濃度的增加而增大，在500 μg/mL時(shí)黃藥葉總黃酮提取物對(duì)羥自由基的清除率為（51.87±1.18）%，低于L-抗壞血酸的（79.43±2.65）%。另外，由表4和表5可知，L-抗壞血酸的IC50為323.50 μg/mL，而黃藥葉總黃酮提取物的IC50為484.12 μg/mL，是L-抗壞血酸的1.50倍。以上結(jié)果表明黃藥葉總黃酮提取物對(duì)羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力，且與濃度具有量效關(guān)系。

2.3.2 DPPH自由基清除率測(cè)定

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除作用見(jiàn)圖9。

圖9 黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.9 DPPH radical scavenging effects of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves and L-ascorbic acid

由圖9可知，黃藥葉總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力弱于同濃度的L-抗壞血酸，兩者對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增加而增大，到達(dá)一定濃度后增長(zhǎng)趨于平緩。L-抗壞血酸及黃藥葉總黃酮提取物分別在 0.5 μg/mL ～ 8 μg/mL、0.5 μg/mL ～ 40 μg/mL 范圍時(shí)對(duì)DPPH自由基的清除率與其濃度相關(guān)性較好。由回歸方程得L-抗壞血酸的IC50為4.06 μg/mL，而黃藥葉總黃酮提取物的IC50為18.27 μg/mL，是L-抗壞血酸的4.50倍。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，當(dāng)黃藥葉總黃酮提取物濃度為40 μg/mL時(shí)，清除率最大為（89.99±0.11）%，僅與L-抗壞血酸相差5.95%。因此，黃藥葉總黃酮提取物對(duì)DPPH自由基清除能力雖不及L-抗壞血酸，但也具有一定程度的清除作用。

2.3.3 超氧陰離子自由基清除率測(cè)定

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用見(jiàn)圖10。

圖10 黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.10 Scavenging ability against superoxide anion radicals of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves and L-ascorbic acid

由圖10可知，當(dāng)濃度小于10 μg/mL時(shí)，黃藥葉總黃酮提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果較L-抗壞血酸略強(qiáng)；當(dāng)濃度大于10 μg/mL時(shí)，隨著濃度的增大，L-抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基清除能力略優(yōu)于黃藥葉總黃酮提取物清除能力，當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)，黃藥葉總黃酮提取物對(duì)超氧陰離子自由基清除率為（51.68±0.23）%，而L-抗壞血酸則為（99.30±0.22）%，兩者清除率差值達(dá)最大值。黃藥葉總黃酮提取物對(duì)超氧陰離子自由基的IC50為46.88 μg/mL，為L(zhǎng)-抗壞血酸IC50的2.51倍，表明黃藥葉總黃酮提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力雖弱于L-抗壞血酸，但仍具有較強(qiáng)的超氧陰離子自由基的清除能力。

2.3.4 鐵離子還原能力

黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸的鐵離子還原能力見(jiàn)圖11。

圖11 黃藥葉總黃酮提取物和L-抗壞血酸的鐵離子還原能力Fig.11 Ferric reducing ability of total flavonoids from Premna cavaleriei Levl.leaves and L-ascorbic acid

鐵離子還原能力以吸光度值衡量，吸光度值越大，還原能力越強(qiáng)。由圖11可知，黃藥葉總黃酮提取物在5 μg/mL～300 μg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度升高吸光度值不斷增大；在300 μg/mL～400 μg/mL時(shí)吸光度值趨于平穩(wěn)且與L-抗壞血酸吸光度曲線重合，表明黃藥葉總黃酮提取物具有較強(qiáng)的鐵離子還原能力。

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助提取法提取武當(dāng)山地區(qū)野生黃藥葉總黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，獲取最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取次數(shù) 3 次，提取時(shí)間 40 min，料液比 1∶30（g/mL），此工藝條件下，得率為6.18%，即提取量為61.8 mg/g。與傳統(tǒng)醇提法相比，本研究所得最佳提取工藝條件可縮短提取時(shí)間，避免長(zhǎng)時(shí)間提取對(duì)活性成分的影響，提高黃藥葉總黃酮的提取量和效率。此外體外抗氧化活性研究表明，黃藥葉總黃酮提取物對(duì)羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基均具有清除作用，且具較強(qiáng)的鐵離子還原能力；同時(shí)在一定濃度范圍內(nèi)，抗氧化能力與濃度呈正相關(guān)。黃藥葉總黃酮提取物對(duì)羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的IC50為484.12、18.27、46.88 μg/mL，分別為 L-抗壞血酸的1.50、4.50、2.51倍；此外，其鐵離子還原能力略低于L-抗壞血酸。本文首次對(duì)武當(dāng)山野生黃藥葉總黃酮提取工藝及體外抗氧化活性進(jìn)行研究，可為當(dāng)?shù)匾吧S藥葉明確營(yíng)養(yǎng)成分及活性物質(zhì)奠定研究基礎(chǔ)，以及為黃藥藥食同源相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供了理論支撐。