張正海，董艷，姬妍茹，楊慶麗

（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163316）

單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）被認(rèn)為是全球四大食源性致病菌之一，易污染各類食品，并對惡劣環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受能力，能夠克服食品運(yùn)輸、貯藏、加工中的各種不利因素，在4℃冰箱、高鹽環(huán)境以及pH 4.5的酸性條件中仍可緩慢生長[1]。該菌可引起人類罹患各種疾病，且具有很高的發(fā)病率和致死率[2]。根據(jù)受感染者的身體健康狀況差異，表現(xiàn)出不同癥狀[3]：健康成年人感染該菌，表現(xiàn)為流感樣癥狀，具有自限性；老年人、幼兒和免疫缺陷人群為該菌易感人群，受感染可能會引發(fā)致命性疾病，如膿毒癥、菌血癥和腦膜炎；圍產(chǎn)期女性感染會導(dǎo)致早產(chǎn)或流產(chǎn)。防腐劑在食品工業(yè)中尤為重要，鑒于傳統(tǒng)防腐劑（如山梨酸鉀、苯甲酸鈉等）長期大量攝入可能造成毒性累積，引起腸胃功能衰退，增加肝臟負(fù)擔(dān)，還可能導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性[4]。因此，從兼顧來源廣、副作用小、抗菌譜廣、耐藥性低等優(yōu)點(diǎn)的天然植物中尋找有價值的替代品，控制Lm，對于保障食品安全具有重要意義。

工業(yè)大麻（Cannabis sativa L.），為大麻科、大麻屬，一年生草本植物，自古以來是纖維和食物的重要來源[5]。作為纖維來源，工業(yè)大麻莖稈可用作紙張、布匹、繩索、木炭等。作為食物來源，工業(yè)大麻籽油因豐富的多不飽和脂肪酸，可作為高端食用油或膳食補(bǔ)充劑，具有預(yù)防糖尿病、高血壓和心腦血管疾病等功效[6]。此外，工業(yè)大麻籽蛋白含多種必需氨基酸，易于消化和低致敏性，因此是理想的食物蛋白來源[7]。近年來，大麻籽油、大麻蛋白粉、大麻牛奶、大麻啤酒、大麻漢堡等營養(yǎng)和功能性食品的需求不斷增長，工業(yè)大麻的種植面積也隨之增大。

工業(yè)大麻葉已被證明對多種細(xì)菌具有抑制作用，雋惠玲等[8]研究顯示工業(yè)大麻葉對金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌兩種常見食源性致病菌有抑制作用。Mkpenie等[9]考察了萃取溶劑種類和提取條件對工業(yè)大麻葉的抗菌活性的影響，推測其活性差異可能與提取物中的多酚含量有關(guān)。郭孟璧等[10]認(rèn)為工業(yè)大麻葉雌株花葉多糖對金黃色葡萄球菌具有抑菌效果，最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為6.25 mg/mL。Marini等[11]證明工業(yè)大麻葉精油可能成為一種有效降低食品中Lm污染的天然防腐劑。前期研究確定了工業(yè)大麻葉乙酸乙酯萃取部位對Lm的MIC為15.63 mg/mL，且針對模擬食品體系的主要因素，如輻照殺菌、加熱處理、蔗糖和氯化鈉等食品調(diào)味劑的添加，仍表現(xiàn)出良好的抑菌穩(wěn)定性[12]，但有關(guān)工業(yè)大麻葉對Lm的抑菌組成和抑菌機(jī)制尚不明確。

本研究通過對工業(yè)大麻葉萃取后硅膠柱分離，比較石油醚-乙酸乙酯不同比例組分對Lm的抑菌活性，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS）分析高活性組分揮發(fā)性化合物組成，進(jìn)一步從對細(xì)胞壁完整性、膜通透性、能量代謝、氧化損傷的影響角度分析工業(yè)大麻葉對Lm的作用機(jī)理，以期為以工業(yè)大麻葉成分為先導(dǎo)化合物開發(fā)新型天然防腐劑以及食品工業(yè)中防治Lm污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

工業(yè)大麻葉：采自黑龍江省大慶市東風(fēng)農(nóng)場；Lm標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC19115）：上海魯微科技有限公司；硅膠粉：青島海洋生物有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；溶菌酶（20 000 U/mg）：上海吉至生化科技有限公司；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、叔丁醇（分析純）：遼寧泉瑞試劑有限公司。

7890B-7000C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司；Epoch多功能酶標(biāo)儀：美國Biotek公司；UV759紫外可見分光光度計：上海高致精密儀器有限公司；VFD-4560真空冷凍干燥機(jī)：上海博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司；JSM7200F掃描電子顯微鏡：日本電子株式會社。

1.2 試驗方法

1.2.1 工業(yè)大麻葉提取物的制備

參考張正海等[12]的方法，工業(yè)大麻葉經(jīng)乙醇提取、乙酸乙酯萃取，減壓濃縮后以1.5倍100目～200目硅膠拌樣，200目～300目硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯（1∶0、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1，體積比）梯度洗脫，結(jié)合薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）合并相似洗脫液，得到 Fr.1：0、Fr.50：1、Fr.20：1、Fr.10：1、Fr.5：1、Fr.1：1、Fr.0：1 共 7 個組分，減壓濃縮后用10%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）調(diào)整濃度至10 mg/mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾除菌后，4℃保存，用于抑菌試驗。

1.2.2 最低抑制濃度的測定

采用96孔板結(jié)合微量肉湯梯度稀釋法，向96孔板中加入90 μL/孔菌懸液和10 μL/孔不同濃度的工業(yè)大麻葉提取物，使其終濃度分別為1 000、500、250、125、62.5、31.25、16、8、4 μg/mL，同時設(shè) 10%DMSO 作為對照，37℃靜置培養(yǎng)24 h，肉眼直接觀察，以不出現(xiàn)渾濁的最低濃度為MIC。

1.2.3 GC-MS化學(xué)成分分析

對Lm的活性篩選，選取活性最佳的組分進(jìn)行GCMS 分析。GC 條件：HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），載氣He，流速1.1 mL/min；升溫程序：100℃保持1 min，以10℃/min升至280℃保持12 min，不分流；MS條件：四極桿溫度150℃，電子轟擊離子源70 eV，接口溫度 240℃，掃描范圍50.0 amu～500.0 amu。

1.2.4 菌懸液中AKP活性和電導(dǎo)率的測定

將對數(shù)生長期的菌懸液濃度調(diào)整為106CFU/mL，加入工業(yè)大麻葉提取物，使其終濃度分別為0 MIC、1/2 MIC、1 MIC，以0 MIC為對照組。37℃振蕩培養(yǎng)，每間隔2 h取5 mL菌液，依照試劑盒說明書的步驟測定上清液AKP活性、去離子水稀釋20倍后電導(dǎo)率儀測定各時間點(diǎn)電導(dǎo)率[13]。

1.2.5 胞內(nèi)ATP含量和SOD活性的測定

菌液處理同 1.2.4，培養(yǎng)過程中分別于 0、2、4、6、8、10 h取1 mL菌液，以0 h為對照組。4℃離心后棄上清液，菌體用500 μL濃度為10 mg/mL的溶菌酶處理20 min，按各自試劑盒說明書測定菌體ATP含量[14]和SOD 活性[15]。

1.2.6 掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察及樣品制備

參考Su等[16]的方法并稍作修改，將對數(shù)生長期的菌液濃度調(diào)整為107CFU/mL，取10 mL菌液加入工業(yè)大麻葉提取物使其終濃度分別為0 MIC、1 MIC，以0 MIC為對照組。于37℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)10 h。用0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次，離心收集菌體，2.5%戊二醛溶液固定過夜。依次用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇梯度脫水，叔丁醇置換。-20℃預(yù)凍后真空冷凍干燥機(jī)干燥，噴金后SEM觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗重復(fù)3次，試驗結(jié)果取平均值，GraphPad Prism 7軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 工業(yè)大麻葉不同組分對Lm的抑菌活性

10% DMSO 對照和 Fr.1：0、Fr.50：1、Fr.20：1、Fr.10：1、Fr.5：1各組孔內(nèi)均出現(xiàn)明顯渾濁，表現(xiàn)為供試濃度內(nèi)對Lm的生長沒有明顯影響。工業(yè)大麻葉Fr.1：1和Fr.0：1對Lm的MIC值分別為62.5μg/mL和1000μg/mL，說明抑菌活性成分大部分富集于Fr.1：1。以此為依據(jù)，選擇Fr.1：1分析其化學(xué)組成并探討其抑菌機(jī)理。

2.2 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分的GC-MS結(jié)果

工業(yè)大麻葉Fr.1：1揮發(fā)性成分總離子流圖見圖1，工業(yè)大麻葉Fr.1：1 GC-MS鑒定結(jié)果見表1。

圖1 工業(yè)大麻葉Fr.1：1揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograph of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves

表1 工業(yè)大麻葉Fr.1：1 GC-MS鑒定結(jié)果Table 1 GC-MS identification of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves

結(jié)合圖1和表1可知，經(jīng)GC-MS共鑒定出24種揮發(fā)性化合物，占相對含量的96.36%，其中酯類14種（75.37%），醇類3種（9.61%），酚類3種（4.74%），烯烴類 2種（4.27%），酮類 1種（0.59%），酰胺類 1種（1.78%）。主要化合物有亞麻酸甲酯（40.79%）、十六酸甲酯（13.12%）、9-順式，11-反式癸二烯酸甲酯（4.55%）、異硬脂酸甲酯（4.42%）、9-十八烯-1-醇（4.38%）和新植二烯（3.3%）等。

2.3 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分的抑菌機(jī)理

2.3.1 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對菌體細(xì)胞壁的影響

工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對Lm的AKP含量的影響見圖2。正常情況下AKP僅存在于細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間，菌懸液AKP含量的變化可間接反映菌體細(xì)胞壁完整性。

圖2 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對菌懸液AKP含量的影響Fig.2 Effect of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves on the AKP content of Lm suspension

由圖2所示，對照組AKP含量始終處于較低水平（0.807 U/L～1.028 U/L）。1/2 MIC工業(yè)大麻葉提取物處理后，菌液在6 h達(dá)到最大值（3.527 U/L）。當(dāng)Fr.1：1濃度從1/2 MIC升高至1 MIC時，上清液AKP水平在2 h內(nèi)迅速上升至7.811 U/L，之后趨于平穩(wěn)狀態(tài)。其它抑菌藥物如對苯二酚也有類似發(fā)現(xiàn)[17]。這表明工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分短時間內(nèi)能有效破壞Lm細(xì)胞壁的完整性，其中1 MIC的Fr.1：1的破壞程度較1/2 MIC更為明顯。

2.3.2 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對細(xì)胞膜通透性的影響

當(dāng)細(xì)胞膜遭到破壞，通透性增加，內(nèi)部的電解質(zhì)會外泄至胞外，進(jìn)而使培養(yǎng)液電導(dǎo)率改變，因此菌液電導(dǎo)率的變化反映了細(xì)胞膜通透性的變化[16]。工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對細(xì)胞上清液電導(dǎo)率的影響見圖3。

圖3 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對細(xì)胞上清液電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves on electric conductivity of culture supernate

由圖3所示，0 h添加抑菌物質(zhì)的菌液電導(dǎo)率較對照組有一定程度的下降，可能是藥物與外泄離子發(fā)生靜電結(jié)合，從而導(dǎo)致離子濃度降低，電導(dǎo)率下降。隨著培養(yǎng)時間的延長，對照組電導(dǎo)率呈現(xiàn)上升趨勢并趨于平衡，但變化幅度較小，這可能與細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境的變化有關(guān)。而經(jīng)1 MIC工業(yè)大麻葉提取物作用后2 h培養(yǎng)液電導(dǎo)率急劇上升36.70%，且始終高于1/2 MIC組。表明工業(yè)大麻葉Fr.1：1可對Lm細(xì)胞膜造成破壞，其破壞程度與其濃度成正相關(guān)。

2.3.3 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對菌體能量代謝的影響

細(xì)胞內(nèi)ATP水平是評價微生物可用能量的重要參數(shù)[14]，不同濃度的Fr.1：1作用后Lm胞內(nèi)ATP水平的變化見圖4。

圖4 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對Lm的ATP含量影響Fig.4 Effect of Fr.1：1 fractions from industrial hemp leaves on the ATP content of Lm

由圖4可知，對照組細(xì)胞內(nèi)ATP隨時間變化呈上升趨勢，而在1/2 MIC和1 MIC Fr.1：1存在的情況下，細(xì)胞內(nèi)ATP含量在2 h升高，并在10 h分別降低至12.115 μmol/L 和 9.250 μmol/L，較 0 h 分別降低了79.26%和84.50%。這可能是由于添加抑菌物質(zhì)對菌體產(chǎn)生了刺激，而細(xì)胞為維持正常生理功能出現(xiàn)應(yīng)激，ATP含量在2 h內(nèi)上升。最終細(xì)菌因電解質(zhì)的損失，導(dǎo)致質(zhì)子動力的降低，影響還原氫的利用，從而使ATP的合成受到抑制[18]。Su等[16]提出膜通透性的增加也可能導(dǎo)致胞內(nèi)ATP濃度的降低。另外，細(xì)胞內(nèi)ATP含量的降低也可能是細(xì)胞過度消耗ATP造成的。因此，工業(yè)大麻葉Fr.1：1會抑制Lm能量代謝。

2.3.4 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對菌體氧化損傷的影響

研究表明，促氧化作用可能是化合物發(fā)揮抑菌活性的機(jī)制之一[15]。自由基能攻擊生物膜并引起細(xì)胞損傷，形成丙二醛等過氧化物，SOD是細(xì)胞中重要的抗氧化保護(hù)酶，工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對菌體氧化損傷的影響見圖5。

圖5 工業(yè)大麻葉Fr.1：1組分對Lm的SOD活性影響Fig.5 Effect of Fr.1：1 fractions from hemp leaves on the SOD activity of Lm

由圖5可知，對照組SOD活力相對穩(wěn)定且維持在較低水平，說明細(xì)胞生物膜未受明顯損傷。不同濃度Fr.1：1處理后，前期SOD活力增加，1/2 MIC和1 MIC組分別在6 h和8 h達(dá)到最大值0.333 U和0.403 U，較對照組分別提高25.19%和46.55%，推測提取物參與了Lm的促氧化過程，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧自由基的增加，誘導(dǎo)SOD基因的表達(dá)，但后期由于膜脂過氧化的加重等導(dǎo)致保護(hù)酶水平的降低，使菌體自身防御能力下降，在持續(xù)提取物逆境脅迫下，Lm生長受到抑制。

2.3.5 工業(yè)大麻葉提取物對細(xì)胞顯微特征的影響

工業(yè)大麻葉提取物處理前后Lm的掃描電鏡結(jié)果見圖6。

圖6 工業(yè)大麻葉提取物處理前后Lm的掃描電鏡圖Fig.6 SEM plot of Lm before and after treatment of industrial cannabis leaf extracts

如圖6所示，對照組Lm（A1～A3）細(xì)胞表面光滑、外觀飽滿且形態(tài)較完好；經(jīng)1 MIC提取物處理10 h后（B1～B3），菌體表面粗糙不平整，可見明顯破潰的菌體（箭頭處）。

3 討論與結(jié)論

為探索以工業(yè)大麻葉成分為先導(dǎo)化合物開發(fā)抗Lm新型防腐劑，以活性為導(dǎo)向篩選工業(yè)大麻葉抑菌活性組分，乙酸乙酯萃取組分經(jīng)體積比為1∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脫后所得組分Fr.1：1對Lm抑菌效果最好，MIC值為62.5 μg/mL；共鑒定出24種揮發(fā)性化合物，其中含量最高的兩種化合物是亞麻酸甲酯和十六酸甲酯，相對含量分別占到40.79%和13.12%。據(jù)報道，亞麻酸甲酯也是香青菜揮發(fā)油抑菌活性化合物中的主要成分[19]，而棕櫚酸甲酯被證實(shí)是核桃殼中殺螨[20]和有效控制香蕉中根結(jié)線蟲的生物活性化合物[21]，但工業(yè)大麻葉對Lm的抑菌活性也可能是其中的微量化合物或是不同化合物之間的協(xié)同作用[22]。Appendino等[23]比較了工業(yè)大麻葉中多種大麻素的結(jié)構(gòu)及抑菌活性差異，發(fā)現(xiàn)大麻素的異戊二烯基對抗菌作用影響較小，而大麻素羧基的酯化和酚羥基的甲基化、乙酰化都不利于抗菌活性，但其研究對象僅限于大麻素且活性機(jī)制尚不明確。經(jīng)Fr.1：1處理后，Lm培養(yǎng)液中AKP活性升高，培養(yǎng)液電導(dǎo)率增大，結(jié)合SEM，表明細(xì)胞完整性遭到破壞；胞內(nèi)ATP含量和SOD活性最終下降，說明菌體能量代謝受到影響并造成質(zhì)膜氧化損傷，最終使Lm生長受到抑制。本研究為工業(yè)大麻葉在抑菌和食品保鮮方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。