李朝輝 劉大威 夏添明 孫生安 王云帥

（鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)市中心醫(yī)院胃腸外科，河南 洛陽(yáng) 471000）

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是胃腸道常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，隨著生活方式的改變和環(huán)境等因素的影響，其發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌患者早期癥狀不典型，導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已是腫瘤晚期，造成治療延誤，病死率居高不下[1]。

微小RNA（MicroRNA，miR）是一種非編碼單鏈核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA），數(shù)量不多，但參與多種基因水平的調(diào)控，在機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。研究表明miR-1273g-3p 在胰腺癌中高表達(dá)[4]，而本課題組既往研究顯示，miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌患者血清中也呈高表達(dá)，但是否具有促癌基因的作用未做研究。因此本文以結(jié)直腸癌HCT116 和SW480 細(xì)胞株為研究對(duì)象，以miR-1273g-3p 模擬物轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞，檢測(cè)miR-1273g-3p 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移的影響，以探究miR-1273g-3p 對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 和SW480（卓越創(chuàng)新中心）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（Sigma）；LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent、Opti-MEMTM（Ⅰnvitrogen）；Trizol 總RNA 提取試劑盒（天根）；miR-1273g-3p mimics 雙鏈及其陰性對(duì)照（上海吉瑪）；miR-1273g-3p 引物和U6 內(nèi)參引物（天根）；聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑、反轉(zhuǎn)錄（Reverse Transcription，RT）試劑盒（天根）；噻唑藍(lán)（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

以含10% FBS 的DMEM 在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116 和SW480。

1.2.2 過(guò)表達(dá)miR-1273g-3p 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

以100 nM Lip2000 將miR-1273g-3p 模擬物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HCT116 和SW480 細(xì)胞，獲得miR-1273g-3p 過(guò)表達(dá)的細(xì)胞。用未行轉(zhuǎn)染處理的HCT116 和SW480 細(xì)胞分別做對(duì)照。在DMEM（含10% FBS）培養(yǎng)基、37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.3 PCR 檢測(cè)miR-1273g-3p 表達(dá)采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，以紫外光分光光度計(jì)A260/A280 檢測(cè)RNA 濃度。采用miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒，在42℃ 60 min（miRNA 加A 尾反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），95℃ 3 min（酶失活反應(yīng)）條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。RT-PCR 采用miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司）。PCR 反應(yīng)以U6 為內(nèi)參，在95℃ 15 min 1 cycle，94℃ 20 s、60℃ 34 s 40 cycle 條件下反應(yīng)。相應(yīng)的引物見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析。

表1 引物序列

1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，鋪板于96 孔平底板使待測(cè)細(xì)胞密度在103-104/孔，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育，待細(xì)胞單層鋪滿(mǎn)板底，加入0.5%MTT 溶液20 μL，每孔設(shè)置3 復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。繼續(xù)孵育4 h 后，小心棄上清液，每孔加入DMSO 200 μL，低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在 630 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量并記錄每孔的光密度（Optical density，OD）值。

1.2.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

將細(xì)胞撤血清饑餓12-24 h 后消化并重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度5×105。取200 μL 細(xì)胞懸液加入transwell 上室，下室加入5%FBS 培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。取出小室，用棉簽將上層小室內(nèi)細(xì)胞輕輕擦拭干凈，用4%IFA（多聚甲醛）將下室細(xì)胞固定30 min，PBS 漂洗2 次后用1%結(jié)晶紫染色20 min，水洗后于顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-1273g-3p 經(jīng)轉(zhuǎn)染后在HCT116 和SW480細(xì)胞中的表達(dá)

聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miRNA-1273g-3p 表達(dá)顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-1273g-3p 模擬物后，HCT116 和SW480 細(xì)胞中miRNA-1273g-3p 的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較明顯提高（P＜0.01），見(jiàn)圖1；證明轉(zhuǎn)染成功，外源性 miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌HCT116 和SW480 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

圖1 miRNA-1273g-3p 的相對(duì)表達(dá)量

2.2 過(guò)表達(dá)miR-1273g-3p 對(duì)HCT116 和SW480細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染miR-1273g-3p 模擬物72h 后，過(guò)表達(dá)組中HCT116 和SW480 細(xì)胞增殖比例明顯高于對(duì)照組（P<0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-1273g-3p 對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞增殖的影響

2.3 過(guò)表達(dá)miR-1273g-3p 對(duì)HCT116 和SW480細(xì)胞遷移的影響

轉(zhuǎn)染miR-1273g-3p 模擬物72 h 后，過(guò)表達(dá)組中HCT116 和SW480 細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組（P<0.01），表3 和圖3。

圖3 過(guò)表達(dá)miR-1273g-3p 對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞遷移的影響

表3 過(guò)表達(dá)miR-1273g-3p 對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞遷移的影響（±SD，n=3）

表3 過(guò)表達(dá)miR-1273g-3p 對(duì)HCT116 和SW480 細(xì)胞遷移的影響（±SD，n=3）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01。

組別 細(xì)胞數(shù)量HCT116 SW480未轉(zhuǎn)染組 445.00±20.298 404.00±19.519轉(zhuǎn)染組 843.67±23.007** 827.67±27.006**

3 討論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，近十年來(lái)結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸上升[5]。開(kāi)展結(jié)直腸癌相關(guān)分子機(jī)制研究，尋找新的治療靶點(diǎn)、分子標(biāo)志物等，對(duì)改善結(jié)直腸癌患者的生存預(yù)后具有極其重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。

目前研究表明，miRNA 異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，有望成為腫瘤治療的新方向[6-8]。

在卵巢癌中，miR-1273g-3p 可以調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子-a（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、α1-Ⅰ型膠原基因（Type α1-Ⅰ collagen gene，COL1A1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase 2，MMP-2 ）、 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶-9 （ Matrix metalloproteinase 9，MMP-9）等基因的表達(dá)水平，同時(shí)可作為化療后復(fù)發(fā)性上皮性卵巢癌診斷的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物[9]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA （Long non-coding RNA，LncRNA）RP11-279C4.1 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-1273g-3p/色素框同源物3（Chromobox homolog 3，CBX3）軸來(lái)增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性行為[10]。而miR-1273g-3p 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞功能的影響及機(jī)制目前尚不清楚。

本研究首先通過(guò)RT-PCR 發(fā)現(xiàn)miR-1273g-3p在HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞中高表達(dá)；接著通過(guò)miR-1273g-3p模擬物轉(zhuǎn)染使HCT116和SW480細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-1273g-3p 發(fā)現(xiàn)，miR-1273g-3p 能促進(jìn)HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞的增殖和遷移。這說(shuō)明miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌中可能起著促癌作用。但我們的研究沒(méi)有檢測(cè)miR-1273g-3p 水平下調(diào)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移能力的影響。且 miR-1273g-3p 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞 HCT116、SW480 細(xì)胞功能的影響的具體分子機(jī)制目前尚不明確，這是后續(xù)進(jìn)一步研究的方向。本研究的對(duì)象是結(jié)直腸癌細(xì)胞，進(jìn)一步可以研究miR-1273g-3p 表達(dá)情況與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)一步探究miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌中的作用。

總之，本研究結(jié)果顯示miR-1273g-3p 可能具有促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、SW480 的增殖和遷移能力，從而在結(jié)直腸癌細(xì)胞中起促癌因子的作用。為進(jìn)一步研究miR-1273g-3p 在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制提供了一定基礎(chǔ)。