王文亮，郭佳(寧夏泰益欣生物科技有限公司，寧夏 銀川 750205)

0 引言

阿維菌素是一個(gè)十六元環(huán)內(nèi)酯與一個(gè)二齊墩果糖結(jié)合生成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，因其具有廣譜、高效和低毒的殺蟲效果，在國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)，也是我國(guó)主要的出口產(chǎn)品之一，在國(guó)外市場(chǎng)中也占據(jù)重要的地位。阿維菌素的發(fā)酵產(chǎn)物具有8種同分異構(gòu)體，其中以B1a的抗菌殺蟲效果最佳[1]。近年來(lái)，阿維菌素的研究較為廣泛，涉及到阿維菌素高產(chǎn)菌種的選育、發(fā)酵工藝的優(yōu)化及阿維菌素生物合成過(guò)程控制等研究，傳統(tǒng)的育種或工藝優(yōu)化已難以滿足企業(yè)提升阿維菌素發(fā)酵產(chǎn)量需求，但阿維菌素生物合成過(guò)程中前體物質(zhì)的添加將是一個(gè)研究熱點(diǎn)[2]。

阿維菌素是由鏈霉菌中阿佛曼菌(Streptomyces avermitilis) 發(fā)酵產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)脂類化合物。1975年，日本Kitasato Institute (北里大學(xué))大村智教授研究土壤微生物時(shí)，分離獲得一株阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis MA-4680)，研究其活性發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵液具有殺蟲、殺螨、殺線蟲、驅(qū)腸道寄生蟲的活性，且對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性較低，即使將發(fā)酵液濃縮后，藥物的濃度提升為原來(lái)的8倍，也無(wú)至毒效果[4]。1976年美國(guó)Merck公司經(jīng)對(duì)阿維菌素發(fā)酵液研究，分離獲得一組十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，將它命名為Avermectin，中文名阿維菌素、或稱阿弗菌素或埃維菌素。阿維菌素的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用是繼青霉素以來(lái)抗生素科學(xué)對(duì)人類的又一巨大貢獻(xiàn)，對(duì)全世界的農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)起到了巨大的促進(jìn)作用[3]。

其生物合成是以乙酸、丙酸等簡(jiǎn)單有機(jī)化合物開始的，目前，已有報(bào)道顯示纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸及丙酸鈉等物質(zhì)均為阿維菌素合成過(guò)程中重要的前體物質(zhì)。劉釔君等將丙酸鈉和異亮氨酸添加至阿維菌素發(fā)酵瓶培養(yǎng)基中，結(jié)果顯示兩種添加物均不利于阿維菌素的生物合成，并且對(duì)阿維菌素發(fā)酵液的pH和菌濃均產(chǎn)生了一定影響。吳暉等研究發(fā)現(xiàn)丙酸鈉比乙酸鈉更適合作為阿維菌素合成的前體物質(zhì)，有利于提升阿維菌素的生產(chǎn)能力[5]。因此本研究主要考察纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸等氨基酸對(duì)阿維菌素發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

YP4002電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)，XDW25搖瓶機(jī)(江蘇同君儀器科技有限公司)，waters2487型HPLC(江蘇塞恩斯科技有限公司)。

1.2 試劑

黃豆餅粉、玉米淀粉(寧夏泰益欣生物科技有限公司)，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸(河南冠琪生物科技有限公司)，硫酸銨、碳酸鈣、氯化鈷、硫酸錳、鉬酸鈉(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純)。

2 材料與方法

2.1 菌種來(lái)源

本試驗(yàn)菌種阿弗曼菌(Streptomyces avermitilis)，由寧夏泰益欣生物科技有限公司提供。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 溶液配制

稱取一定量的化學(xué)純纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸置于燒杯中加入少量的純化水，水浴加熱用純化水進(jìn)行溶解阿維菌素的發(fā)酵培養(yǎng)。

2.2.2 阿維菌素含量測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中阿維菌素的含量，條件為：C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm，流動(dòng)相為甲醇∶水=9∶1。

3 結(jié)果與分析

3.1 三種氨基酸對(duì)阿維菌素生物合成的影響

大環(huán)內(nèi)脂類抗生素的合成一般都是由一些氨基酸作為前體物質(zhì)進(jìn)行合成的，因此加入一定量的前體物質(zhì)有助于產(chǎn)物的合成，本研究在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加三種10 mmol/ L 前體物質(zhì)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，與不加任何前體物質(zhì)的普通培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)，然后用同一瓶種子液轉(zhuǎn)發(fā)酵，在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)11 d后測(cè)定阿維菌素發(fā)酵單位。

如圖1所示，三種前體物質(zhì)的添加均對(duì)阿維菌素發(fā)酵單位均有一定的影響，能提升阿維菌素的發(fā)酵單位，添加10 mmol/ L 的前體物質(zhì)，分別高于對(duì)照3.89%、2.47%和1.29%。因此，這三種氨基酸對(duì)阿維菌素具有提升化學(xué)效價(jià)的作用。

圖1 三種氨基酸對(duì)阿維菌素生物合成的影響

3.2 不同氨基酸在不同濃度下對(duì)阿維菌素發(fā)酵單位的影響

在阿維菌素發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中添加不同濃度的氨基酸，將3中氨基酸配制成不同濃度的水溶液，分別在發(fā)酵培養(yǎng)基 中 添 加0 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L濃度的氨基酸，培養(yǎng)11 d后取樣測(cè)定阿維菌素的化學(xué)效價(jià)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同氨基酸在不同濃度下對(duì)阿維菌素發(fā)酵單位的影響

從上圖中可以看出纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸對(duì)阿維菌素的生物合成均具有不同程度的影響，其中纈氨酸和亮氨酸對(duì)阿維菌素的發(fā)酵單位具有積極的影響，不同濃度下實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵單位高于對(duì)照組；添加濃度為10 mmol/L時(shí)三種氨基酸的實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照。但添加濃度提升20 mmol/L時(shí)異亮氨酸就對(duì)阿維菌素的生物合成產(chǎn)生了抑制作用；纈氨酸對(duì)阿維菌素的生物合成影響最大，當(dāng)纈氨酸的添加濃度為20 mmol/L時(shí)，化學(xué)效價(jià)達(dá)到了峰值為7 200 u/mL左右，高出對(duì)照組400個(gè)效價(jià)單位。表明纈氨酸和低濃度的亮氨酸可作為前體物質(zhì)進(jìn)行添加，從而提升化學(xué)效價(jià)單位。

3.3 氨基酸對(duì)不同周期發(fā)酵液的影響

經(jīng)過(guò)以上對(duì)氨基酸濃度及種類進(jìn)行篩選，確定出纈氨酸在20 mmol/L的濃度下對(duì)阿維菌素的發(fā)酵單位具有較好的影響，而亮氨酸在30 mmol/L時(shí)對(duì)阿維菌素的生物合成具有較大的影響，分別配制纈氨酸20 mmol/L和亮氨酸30 mmol/L的濃度，發(fā)酵瓶培養(yǎng)過(guò)程中每隔24 h測(cè)定發(fā)酵瓶前中期的pH、菌濃和發(fā)酵效價(jià)單位。

如圖3所示，在配制培養(yǎng)基的過(guò)程中添加一定濃度的纈氨酸和亮氨酸，在發(fā)酵培養(yǎng)前期對(duì)阿維菌素的生物合成具有一定影響，添加纈氨酸后可以有效提升阿維菌素的發(fā)酵單位，高于對(duì)照組500個(gè)效價(jià)單位；添加亮氨酸后，在120 h前實(shí)驗(yàn)組的發(fā)酵效價(jià)高于對(duì)照組，隨著培養(yǎng)周期的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組的化學(xué)效價(jià)漲幅下降，最終發(fā)酵效價(jià)低于對(duì)照組。表明亮氨酸對(duì)阿維菌素的前期合成具有促進(jìn)作用，而纈氨酸對(duì)阿維菌素發(fā)酵效價(jià)具有明顯的提升作用。

圖3 氨基酸度不同周期發(fā)酵液的影響

4 結(jié)語(yǔ)

本研究以纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸作為添加前體物質(zhì)，添加至阿維菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，考察這三種氨基酸對(duì)阿維菌素發(fā)酵單位的影響，結(jié)果表明，纈氨酸可以有效提升阿維菌素的發(fā)酵效價(jià)單位；異亮氨酸在阿維菌素發(fā)酵前期對(duì)阿維菌素的合成無(wú)明顯影響；而亮氨酸在阿維菌素前期的生物合成中具有促進(jìn)作用，后期培養(yǎng)過(guò)程中導(dǎo)致阿維菌素效價(jià)單位低于對(duì)照組，具體原因需進(jìn)一步研究。