張艷麗 唐文慧 蘇軍 馬紅霞

肺癌(lung cancer)是世界上發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，威脅著世界人類的生命健康[1]。由于80%以上為非小細胞肺癌，其確診時大多已至晚期，失去最佳手術(shù)時機，放化療成為肺癌治療的首選[2]。順鉑是癌癥化療最主要的藥物，可抑制腫瘤細胞的DNA 合成，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，達到抑制腫瘤細胞生長的作用[3]。其在肺癌早期和晚期均具有良好的抗癌作用，患者一旦產(chǎn)生耐藥性極易死亡。因此，耐藥成為克服肺癌治療的一大難題。非編碼RNA在各種人類疾病中的關(guān)鍵作用，其可分為短鏈RNA(18～23個核苷酸)和長鏈非編碼RNA(lncRNAs；>200 個核苷酸)[4]，其中l(wèi)ncRNA已經(jīng)成為癌癥生物學(xué)研究中最主要的一類非編碼RNA，據(jù)報道lncRNA可通過靶向miRNA進而調(diào)控相關(guān)基因表達、蛋白質(zhì)合成、RNA轉(zhuǎn)運等[5]。 研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs也調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運并最終調(diào)節(jié)抗性[6,7]。長鏈非編碼RNA HNF1A-AS1(Lnc RNA)在肺癌中發(fā)揮促進癌癥進一步惡化作用[8]，其對肺癌化療的敏感性是否也具有調(diào)控作用，尚且未知。本研究擬檢測順鉑耐藥肺癌細胞H520/DDP中HNF1A-AS1及miR-32-5p的表達，觀察其對H520/DDP順鉑敏感性、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肺鱗狀細胞癌細胞H520購自ATCC；DMEM培養(yǎng)基、MTT均購自美國Sellect公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、LipofectamineTM2000購自大連寶生物工程公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；PVDF膜購自德國Roche Diagnostics公司；ECL發(fā)光液購自Thermo Fisher Scientific公司；SDS-PAGE 試劑盒、RIPA蛋白裂解液均購自Beyotime Biotechnology；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，肺鱗狀細胞癌細胞H520與含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基一起孵育，待H520細胞融合至約75%，胰蛋白酶消化(1 min左右)后以1∶3的比例替換DMEM培養(yǎng)基，每隔1 d傳代1次。

1.2.2 H520/DDP細胞的建立:將正常培養(yǎng)的H520細胞，用含順鉑(2、4、6、8、10、12、14、16……64 μmol/ml)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至第30 d，依次每個濃度培養(yǎng)30 d。最后用64 μmol/ml的順鉑維持H520細胞的耐藥性，得到順鉑耐藥肺癌細胞H520(H520/DDP)。使用MTT法檢測不同濃度順鉑處理的H520細胞的抑制率，并測定H520細胞的順鉑IC50值。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染與分組:將H520/DDP細胞隨機分為si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-HNF1A-AS1組(轉(zhuǎn)染si-HNF1A-AS1)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-32-5p組(轉(zhuǎn)染miR-32-5p mimics)、si-HNF1A-AS1+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-HNF1A-AS1和anti-miR-NC)、si-HNF1A-AS1+anti-miR-32-5p組(共轉(zhuǎn)染si-HNF1A-AS1和anti-miR-32-5p)，通過LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染，用RT-qPCR法檢測轉(zhuǎn)染48 h的效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗。

1.2.4 MTT法檢測H520和H520/DDP細胞的IC50值:將H520和H520/DDP細胞分別制成104個/ml的混懸液，接種至96孔板，依次加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)孵育4 h，150 μl DMSO充分融解結(jié)晶，記錄490 nm處的H520、H520/DDP細胞吸光度(A)。根據(jù)[(1-A490樣品/A490對照)×100%]計算細胞抑制率(%)。以抑制50%細胞生長的藥物濃度為IC50值。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI檢測H520和H520/DDP細胞凋亡:用 500 μl的Binding Buffer懸浮H520或H520/DDP細胞，在黑暗中，將細胞與5 μl Annexin V-/ FITC孵育20 min，后與5 μl PI孵育20 min，于1 h內(nèi)上流式細胞儀進行H520或H520/DDP細胞凋亡檢測。以晚期凋亡率之和為細胞的凋亡率(%)。

1.2.6 RT-qPCR法檢測細胞中HNF1A-AS1、miR-32-5p的mRNA的表達:遵循RNA抽提試劑盒步驟進行H520或H520/DDP細胞RNA提取，定量后分別利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-qPCR試劑盒進行cDNA制備、HNF1A-AS1、miR-32-5p表達檢測。用2-△△Ct=[(CT樣品-CTU6)Treatment group-(CT樣品-CTU6)Control group]計算HNF1A-AS1、miR-32-5p的mRNA的表達。

1.2.7 生物信息學(xué)分析:采用在線靶基因預(yù)測庫Target Scan(http://www.targetscan.org/)預(yù)測HNF1A-AS1與miR-32-5p的結(jié)合位點。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗檢測細胞的熒光活性:將HNF1A-AS1-WT和HNF1A-AS1-MUT的熒光素酶報告載體，通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，分別將其與miR-32-5p、miR-NC共轉(zhuǎn)染，按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊操作，記錄24 h后的螢火蟲和海腎的熒光素酶激發(fā)值，根據(jù)二者之比評價細胞的熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 順鉑耐藥肺癌細胞的建立 與H520組相比，H520/DDP組細胞的IC50值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 流式凋亡圖

表1 順鉑耐藥H520細胞的建立

2.2 順鉑耐藥肺癌細胞中HNF1A-AS1、miR-32-5p的表達 與H520組相比，H520/DDP組細胞中HNF1A-AS1 mRNA顯著升高，miR-32-5p mRNA顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 順鉑耐藥肺癌細胞中HNF1A-AS1、miR-32-5p的表達

2.3 抑制HNF1A-AS1對H520/DDP細胞IC50的影響 與si-NC組相比，si-HNF1A-AS1組H520/DDP細胞的IC50顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 抑制HNF1A-AS1的H520/DDP細胞凋亡

表3 抑制HNF1A-AS1對H520/DDP細胞IC50的影響

2.4 HNF1A-AS1靶向miR-32-5p 生物信息學(xué)預(yù)測顯示，HNF1A-AS1與miR-32-5p 5’UTR端部分堿基可互互補配對。miR-32-5p組WT-HNF1A-AS1細胞的熒光活性顯著低于miR-NC組，miR-32-5p組和miR-NC組MUT-HNF1A-AS1細胞的熒光活性差異不顯著(P<0.05)。anti-miR-32-5p組比anti-miR-NC組顯著提高細胞中HNF1A-AS1 mRNA的表達，miR-32-5p組較miR-NC組顯著降低細胞中HNF1A-AS1 mRNA的表達(P<0.05)。見圖3，表4、5。

圖3 HNF1A-AS1與miR-32-5p的靶向結(jié)合位點

表4 雙熒光素酶報告基因檢測實驗結(jié)果

表5 miR-32-5pHNF1A-AS1表達的影響

2.5 過表達miR-32-5p降低H520/DDP細胞IC50 與miR-NC組相比，miR-32-5p組H520/DDP細胞的IC50值顯著降低，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖4，表6。

圖4 過表達miR-32-5p的H520/DDP細胞的凋亡

表6 過表達miR-32-5p對H520/DDP細胞IC50的影響

2.6 抑制miR-32-5p逆轉(zhuǎn)了抑制HNF1A-AS1對H520/DDP細胞IC50的影響 與si-HNF1A-AS1+anti-miR-NC組相比，si-HNF1A-AS1+anti-miR-32-5p組H520/DDP細胞的IC50值顯著升高，細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖5，表7。

表7 抑制miR-32-5p逆轉(zhuǎn)了抑制HNF1A-AS1對H520/DDP細胞IC50的影響

圖5 抑制miR-32-5p的H520/DDP細胞凋亡

3 討論

隨著人類對Lnc RNA認識的不斷深入，其從轉(zhuǎn)錄“噪音”至人類各種疾病的重要“參與者”，尤其是腫瘤[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Lnc RNA在腫瘤中的異常失調(diào)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，甚至放化療抗性[10]。Wu等[11,12]在肺腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1的表達量與肺癌的分期、腫瘤大小及淋巴轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，促進體內(nèi)和體外癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Zhang等[13,14]報道，HNF1A-AS1促進肺癌細胞增殖、遷移侵襲的機制與靶向miR-17-5p、miR-149-5p/Cdk6有關(guān)。這些研究結(jié)果說明HNF1A-AS1促進肺癌細胞的增殖、遷移侵襲，我們推測其對肺癌細胞凋亡和耐藥性應(yīng)該也具有一定的影響。本研究通過逐步遞增法成功建立的順鉑耐藥H520細胞；用RT-qPCR法檢測了肺癌細胞H520和順鉑耐藥肺癌細胞H520/DDP中HNF1A-AS1的表達發(fā)現(xiàn)，HNF1A-AS1在H520/DDP中的表達顯著升高；進一步研究發(fā)現(xiàn)，抑制HNF1A-AS1可增強順鉑對肺癌細胞的敏感性，促進H520/DDP細胞的凋亡，這說明HNF1A-AS1是肺癌細胞耐藥性和凋亡過程的重要調(diào)控因子，為HNF1A-AS1為基礎(chǔ)的生物治療的開發(fā)提供了實驗依據(jù)。接下來的Target Scan預(yù)測、雙熒光素酶報告基因檢測及RT-qPCR實驗研究發(fā)現(xiàn)，miR-32-5p是HNF1A-AS1的功能性靶標，猜想HNF1A-AS1影響肺癌耐藥性和凋亡的作用可能與靶向肺癌細胞中的miR-32-5p聯(lián)系密切。

miRNA在人類機體的各種癌癥的發(fā)生發(fā)展及放化療抗性中均具有重要的調(diào)控作用。Zhou等[15]在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-32具有腫瘤抑制劑的作用，抑制肺癌細胞的增殖和侵襲，其可作為Linc 00319的靶基因參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。Zhu等[16]報道，miR-32在非小細胞肺癌中的表達明顯下調(diào)，與肺癌的淋巴轉(zhuǎn)移、分期和總生存期均具有明顯的相關(guān)性，且過表達miR-32可抑制癌細胞的增殖、遷移侵襲，促進凋亡，表明miR-32可作為非小細胞肺癌的腫瘤抑制劑，并且可作為基于miRNA治療的新型治療劑。我們推測miR-32-5p在肺癌的順鉑耐藥性中可能也具有一定的調(diào)控作用。本研究檢測了順鉑耐藥肺癌細胞H520/DDP中miR-32-5p的表達發(fā)現(xiàn)，miR-32-5p異常降低，這與前人研究[16,17]相一致；此外，過表達miR-32-5p后，H520/DDP細胞對順鉑的敏感性顯著增強，細胞凋亡顯著增加，說明miR-32-5p不僅具有抑制肺癌細胞的惡性細胞表型的功能，還具有增強順鉑敏感性的功能，為順鉑耐藥肺癌細胞的治療提供新的治療靶點和新的方向。深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-32-5p可逆轉(zhuǎn)抑制HNF1A-AS1的增強H520/DDP細胞敏感性和促凋亡作用，這不僅說明HNF1A-AS1可靶向調(diào)控miR-32-5p，相反，miR-32-5p也可逆向調(diào)控HNF1A-AS1的表達和功能。

綜上所述，長鏈非編碼RNA HNF1A-AS1可增強順鉑耐藥肺癌細胞的敏感性，其機制可能與靶向miR-32-5p有關(guān)，為耐藥肺癌的治療提供新方向。