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        基于二階校正方法的牛乳中沙門氏菌快速檢測(cè)

        2021-11-15 09:30:14邱智軍
        農(nóng)產(chǎn)品加工 2021年19期
        關(guān)鍵詞:沙門氏菌二階波長

        陳 煜,邱智軍,張 彬

        (河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南洛陽 471003)

        牛奶及其制品中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),包括人體生長發(fā)育所需的各種必需氨基酸、非必需氨基酸、礦物質(zhì)和維生素等,是目前普遍受消費(fèi)者歡迎的滋補(bǔ)飲品[1-2]。但其在生產(chǎn)、加工及運(yùn)輸過程中易受到食源性病原微生物的污染,進(jìn)入人體之后會(huì)引發(fā)一系列身體不適,嚴(yán)重威脅人體健康[3]。常見食源性致病菌有沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌等,一般通過攝食感染人體并在體內(nèi)大量繁殖進(jìn)而使人患上感染性疾病或者中毒性疾病[4-5]。而沙門氏菌是一種可以引發(fā)食物中毒的重要食源性病原菌,也是人畜共患病之一[6],被感染者會(huì)引起食物中毒、胃腸炎、腹瀉等疾病,且目前出現(xiàn)越來越多的耐藥性現(xiàn)象,因此建立牛奶中沙門氏菌殘留快速、高效檢測(cè)方法尤為重要。

        目前,關(guān)于沙門氏菌傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有生物化學(xué)法,通過細(xì)菌培養(yǎng),檢測(cè)其在培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物,通過判斷細(xì)菌的分解代謝特征,進(jìn)而達(dá)到細(xì)菌檢測(cè)的目的,該方法成本低、準(zhǔn)確度高,檢測(cè)結(jié)果比較直觀,且能夠得到定性和定量的分析與結(jié)果,但檢測(cè)周期較長,且操作比較繁瑣,不能滿足現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)[7]。近年來,隨著檢測(cè)技術(shù)的革新,一些新的檢測(cè)技術(shù)逐漸被開發(fā)出來,三維熒光檢測(cè)技術(shù)以其靈敏度高、在線檢測(cè)時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而被用于各種微生物的快速鑒別和表征[8-9]。三維熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)主要包括光源、激發(fā)單色器、樣品池、發(fā)射單色器和檢測(cè)器等。首先光源發(fā)出光經(jīng)過激發(fā)單色器得到想要的激發(fā)波長,激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光,然后熒光經(jīng)過發(fā)射單色器被檢測(cè)器收集并變成相應(yīng)的電信號(hào),最后以光譜形式呈現(xiàn)出來[10]。

        三維熒光光譜儀器見圖1。

        圖1 三維熒光光譜儀器

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        1.1.1 試劑

        無菌牛奶,購自洛陽家樂福超市;LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨2 g、酵母粉1 g、NaCl 2 g溶于200 mL蒸餾水,并采用高壓蒸汽滅菌);LB固體培養(yǎng)基(胰蛋白胨6 g、酵母粉3 g、NaCl 6 g、瓊脂12 g溶于1 000 mL蒸餾水,并高壓蒸汽滅菌);生理鹽水(NaCl 0.9 g溶于1 000 mL蒸餾水,并采用高壓蒸汽滅菌)。

        1.1.2 儀器及設(shè)備

        ME204E型電子天平,梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品;QE-3型臺(tái)式恒溫振蕩器,天津市歐諾儀器儀表有限公司產(chǎn)品;HYL-G型恒溫振蕩搖床,江蘇太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品;Cary Eclipse型三維熒光光譜儀,安捷倫科技(中國)有限公司產(chǎn)品。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 菌種活化及擴(kuò)大培養(yǎng)[11]

        使用滅菌的接種環(huán)挑取少量菌種接入含有50 mL的LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,于37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,該步驟為菌種活化。用移液槍吸取50μL活化好的第一代菌懸液于含有50 mL的LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,于37℃下以轉(zhuǎn)速150 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,此步驟為菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)。

        1.2.2 菌懸液的制備[12]

        取第二代菌懸液4 mL于10 mL離心管中,25℃條件下,以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min,去除上清液,向沉淀中加4 mL生理鹽水充分振蕩,以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min,再次去除上清液并入加5 mL生理鹽水懸浮混勻,制成菌懸液。

        1.2.3 校正樣和測(cè)試樣確定

        取1 mL離心后的菌懸液于含有9 mL牛奶的試管中,振蕩搖晃使之混勻,制成1×10-1的稀釋液,取1 mL 1×10-1的稀釋液于含有9 mL牛奶的試管中,振蕩搖晃使之混勻,制成1×10-2的稀釋液,取1×10-1的稀釋液7.5 mL于含有2.5 mL牛奶的試管中制成1×10-1×75%的稀釋液,以相同方法制成1×10-1×50%,1×10-1×25%,1×10-2×75%,1×10-2×50%,1×10-2×25%的稀釋液。試驗(yàn)檢測(cè)用的8個(gè)樣品(空白樣品除外),其高濃度和低濃度區(qū)間跨度較大,且樣品可能存在分布不均狀態(tài),人為操作也可存在誤差,綜合考慮選擇1×10-2×100%和1×10-2×25%中間2個(gè)樣品為測(cè)試樣,選擇其余樣品為校正樣。

        1.2.4 試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置

        牛奶中成分比較復(fù)雜,其各干擾成分均能產(chǎn)生相應(yīng)的熒光,試驗(yàn)選擇激發(fā)波長范圍為250~550 nm,發(fā)射波長范圍為265~700 nm,間隔2 nm取一個(gè)數(shù)據(jù),其中狹縫的寬度選擇5.0/5.0 nm,掃描速度為2 400 nm/min[13]。

        1.2.5 數(shù)據(jù)處理

        牛奶體系中成分十分復(fù)雜,存在眾多干擾因素,因而無法確定準(zhǔn)確組分?jǐn)?shù),故試驗(yàn)使用ATLD算法的二階校正方法進(jìn)行計(jì)算,并利用交替最小二乘原理對(duì)多維數(shù)據(jù)進(jìn)行解析。該方法在定量分析上速度快且準(zhǔn)確度高。

        (1)三線性成分模型。使用激發(fā)發(fā)射熒光光譜儀,在選定的i個(gè)激發(fā)波長,j個(gè)發(fā)射波長下對(duì)K個(gè)樣品(包括校正樣和測(cè)試樣)進(jìn)行掃描并將吸光度值收集在一個(gè)大小為i×j×M的三維數(shù)據(jù)陣X中,該三維數(shù)據(jù)陣中的每個(gè)元素xijk,用數(shù)學(xué)公式表示如下[14]:

        式中:i=1,2,……i;j=1,2,……j;k=1,2,

        ……K;

        xijk——立體陣X的元素(i,j,k),即第k個(gè)樣本在第i個(gè)激發(fā)光波長和第j個(gè)發(fā)射波長下的熒光強(qiáng)度;

        ain——相對(duì)激發(fā)光譜矩陣A(I×N)中的元素(i,n);

        bjn——相對(duì)發(fā)射光譜矩陣B(J×N)中的元素(j,n);

        ckn——相對(duì)濃度矩陣C(K×N)中的元素(k,n);

        eijk——?dú)埐铌嘐(I×J×K)中的元素(i,j,k);

        N——組分?jǐn)?shù),即對(duì)體系做出貢獻(xiàn)的總的組分?jǐn)?shù),包括感興趣的組分、背景和未校正的干擾等。

        (2)ATLD算法。ATLD算法利用最小二乘原理,借助基于切尾奇異值分解(T-SVD)的Moore-Penrose廣義逆計(jì)算進(jìn)行三線性數(shù)據(jù)分解。令a(i)、b(j)、c(k)分別表示矩陣A、B、C中的第i、j、k行,則三維三線性矩陣可表示為[14]:

        式中:a(i)、b(j)、c(k)可分別通過最小化損失函數(shù)得出,損失函數(shù)指的是殘差矩陣元素的平方總和,函數(shù)如下[15]:

        式中:||.||F2表示Frobenius矩陣范數(shù),Xi..、X.j.、X..k分別是三維響應(yīng)數(shù)陣X沿著激發(fā)光波波長、發(fā)射光波長及所測(cè)物質(zhì)濃度方向的第i、j、k個(gè)切片。基于迭代計(jì)算步驟的ATLD二階校正法以切片矩陣方式進(jìn)行計(jì)算,迭代過程中,B和C作歸一化處理[14]。

        (3)品質(zhì)因子。一般采用靈敏度(SNE)、選擇性(SEL)、檢出限(LOD)等指標(biāo)來對(duì)方法的性能進(jìn)行評(píng)估。SNE指的是單位濃度純分析信號(hào),SEL指的是靈敏度與總信號(hào)的比值,由公式(8)和(9)計(jì)算[16-17],LOD[18]可以用3個(gè)背景空白樣預(yù)測(cè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍表示。

        式中:nm——矩陣中的(n,n)個(gè)元素;

        *——Hadamard積;

        k——單位濃度組分n的總信號(hào),表示濃度得分參數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 牛奶中沙門氏菌的三維熒光光譜

        牛奶中的沙門氏菌三維熒光光譜見圖2,牛奶中沙門氏菌的等高線熒光光譜見圖3。

        由圖2可以看出,沙門氏菌三維熒光光譜的發(fā)射光在波長550~675 nm范圍內(nèi)存在一個(gè)較寬的譜峰,其峰值為610 nm,且隨著激發(fā)光強(qiáng)度的增強(qiáng)譜峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),特征峰顯著。由圖3可以看出,在波長455~535 nm范圍內(nèi)和波長390~530 nm范圍內(nèi)存在2個(gè)特征吸收峰,通過圖譜分析發(fā)現(xiàn)其分別為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和甲醛脫氫酶(FADH),且2個(gè)特征吸收峰均產(chǎn)生紅移現(xiàn)象。牛奶中沙門氏菌的三維熒光光譜和等高線熒光光譜均可作為沙門氏菌檢測(cè)的依據(jù),三維熒光光譜檢測(cè)允許存在未知的各種干擾因素,可同時(shí)檢測(cè)分析出多個(gè)樣品的重疊光譜信號(hào),從而用于快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出牛奶中沙門氏菌殘留。

        圖2 牛奶中的沙門氏菌三維熒光光譜

        圖3 牛奶中沙門氏菌的等高線熒光光譜

        2.2 牛奶中沙門氏菌的定量分析

        采用ATLD算法對(duì)通過三維熒光掃描得到的三維數(shù)據(jù)進(jìn)行解析[19]。

        ATLD法與三維熒光結(jié)合測(cè)定牛奶中沙門氏菌(N=3)見表1。

        表1 ATLD法與三維熒光結(jié)合測(cè)定牛奶中沙門氏菌(N=3)

        當(dāng)組分為2時(shí),ATLD算法所得校正集中沙門氏菌的相對(duì)濃度與試劑濃度相關(guān)系數(shù)為0.996 1,預(yù)測(cè)樣中沙門氏菌平均回收率為93.5%±2.3%。

        ATLD算法獲得品質(zhì)因子數(shù)見表2。

        表2 ATLD算法獲得品質(zhì)因子數(shù)

        由表2可知,ATLD算法能較好地分辨出沙門氏菌所激發(fā)的熒光光譜,可實(shí)現(xiàn)對(duì)牛奶中沙門氏菌的直接快速定量檢測(cè),同時(shí)也進(jìn)一步證明二階校正法的“二階優(yōu)勢(shì)”[20]。

        3 結(jié)論

        沙門氏菌是牛奶在生產(chǎn)、加工及運(yùn)輸過程中主要防治的病原微生物污染源。牛奶中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),使得整個(gè)檢測(cè)體系成分復(fù)雜,利用三維熒光光譜技術(shù),結(jié)合基于ATLD的二階校正算法,直接快速對(duì)牛奶中沙門氏菌進(jìn)行定量分析。與常規(guī)的檢測(cè)方法相比,該方法利用二階校正的“二階優(yōu)勢(shì)”,成功地解決了檢測(cè)體系中復(fù)雜成分的干擾問題,實(shí)現(xiàn)牛奶中在干擾物共存下對(duì)沙門氏菌的快速檢測(cè)。

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