徐唐蕓，黃達敏，魯東昊，陸 翔，陳凌濤，陳培云

（浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315000）

隨著人工合成添加劑安全問題的日益凸顯及人們對健康的關注，以植物為原料獲取安全、無毒、高效的生物活性物質已成為當前亟待解決的重要問題[1]。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs），主要是由氯化膽堿（Choline chloride，ChCl）等氫鍵受體與糖（葡萄糖、蔗糖、果糖等）、有機酸（乳酸、蘋果酸、檸檬酸等）、多元醇（乙二醇、丙三醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇）等氫鍵供體組成的液體混合物。作為一種環(huán)境友好型溶劑，低共熔溶劑具有蒸汽壓低、制備簡單、價格低廉、可生物降解、無毒、對不同極性化合物提取能力強、提取效率高、可回收重復利用等優(yōu)點[2-5]，可用于替代傳統(tǒng)或有毒的有機試劑。目前，DESs已被成功應用于植物活性成分的萃取，包括萃取黃芩、丹參、金銀花、木豆葉、降香葉、紅花、槐花、青蒿、夏枯草、茴香等中藥材，橄欖油、棕櫚油等食用油，山竹果、蔓越橘、葡萄、李子等水果，西蘭花、洋蔥等蔬菜，沙棘葉等植物葉子中的黃酮類化合物、酚酸、花青素、萜類化合物、皂苷類和生物堿等，對天然活性成分表現(xiàn)出高效的提取效果[6-13]。

花青素因其抗氧化、抗癌、保護視網(wǎng)膜、降低血脂、抗衰老和改善腸道健康等作用而備受人們的關注[14]。提取花青素常規(guī)提取溶劑多選擇甲醇、乙醇、丙酮、水或者混合溶劑等，大多具有毒性，普遍存在污染環(huán)境的問題。在應用DESs提取植物花青素方面，欒琳琳等人[15]建立了以含水量為40%的氯化膽堿/1,2-丙二醇低共熔溶劑，從桑葚果渣中提取花青素的方法。Sang J等人[16]利用含10%水（V/V）的氯化膽堿/1,2-丙二醇（1∶2，mol/mol）的低共溶熔劑從黑枸杞中提取和分離總花色苷。紫薯色素屬于花青素類物質，含量豐富且穩(wěn)定性高，紫薯產(chǎn)量高，價格低廉，提取成本低，以紫薯為原料可以有效地解決當前工業(yè)化生產(chǎn)花青素的不足。設計合成低共熔溶劑用于紫薯的提取研究，以紫薯中花青素的提取率為指標，采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化紫薯中花青素的提取工藝，以期提供一種高效環(huán)保的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯，購于寧波當?shù)爻?；氯化膽堿、葡萄糖、尿素、蔗糖、醋酸鈉、冰醋酸，國藥集團化學試劑有限公司提供，均為分析純。

1.2 儀器與設備

L18-Y91A型高速破壁調(diào)理機，九陽股份有限公司產(chǎn)品；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市盛藍儀器制造有限公司產(chǎn)品；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海蟻霖科學儀器有限公司產(chǎn)品；QL861型漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；LC-180型低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品；UV-3000PC型紫外可見分光光度計，上海翱藝儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同低共熔溶劑的制備

參照文獻[17]方法制備低共熔溶劑。將氫鍵供體（HBD）氯化膽堿和不同的氫鍵受體（HBA）（葡萄糖、檸檬酸、蔗糖、尿素等）放入60℃真空干燥箱中干燥24 h，在圓底燒瓶中將一定的摩爾比HBD和HBA充分混合。在加熱條件下，用磁力攪拌器攪拌，得到澄清、均勻、透明的混合物。冷卻至室溫后，在真空干燥箱中于80℃下干燥48 h后，將其取出并密封儲存。

1.3.2 紫薯樣品處理

選擇新鮮的紫薯，清洗后90℃下烘干5 h至恒質量，研缽粉碎、過90目篩，得到紫薯粉，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 紫薯花青素的提取

準確稱取1.000 g處理好紫薯樣品，置于試管中。以低共熔溶劑為提取溶劑，加入10 mL于試管中進行水浴提取，提取結束后，離心后取上清液進行花青素的測定。

1.3.4 花青素提取率的測定

參照文獻[18]方法。取上清液1 mL于10 mL比色管中，加入9 mL pH值4.5緩沖液，靜置2 h，紫薯花色苷的最大吸收波長為530 nm。在波長530 nm處測定吸光度。以蒸餾水作對照溶劑調(diào)零。重復測定3次，記錄數(shù)據(jù)。

計算值即得100 g原料中含總花色苷含量（mg）。式中：E——530 nm處用分光光度計直接測定的吸

光度（A530）；

V——萃取液測定時稀釋的總體積，mL；

M——樣品質量，g；

98.2 ——1%花色苷摩爾消光系數(shù)。

1.3.5 單因素試驗

（1）不同低共熔溶劑對紫薯花青素得率的影響。固定含水量20%，摩爾比1∶2，料液比1∶10，浸提時間2 h，浸提溫度60℃，選擇了4種氫鍵供體（檸檬酸、葡萄糖、尿素、蔗糖）和氫鍵受體（氯化膽堿）按2∶1的摩爾比進行組合配制形成天然低共熔溶劑，考查4種不同氫鍵供體低共熔溶劑對紫薯花青素提取的影響。

（2）摩爾比對紫薯花青素得率的影響。固定氯化膽堿-檸檬酸為提取紫薯花青素的DES溶劑，在含水量為20%，料液比為1∶10，溫度為60℃，提取時間為2 h，考查氯化膽堿與檸檬酸摩爾比分別為1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5，1∶4.0時制備的DESs對提取紫薯中花青素的影響。

（3）含水量對紫薯花青素得率的影響。固定氯化膽堿與檸檬酸摩爾比為1∶2，料液比為1∶10，溫度為60℃，浸提時間為2 h，考查含水量為15%，20%，25%，30%，35%的DESs分別進行提取，確定提取效果最佳時的DESs含水量。

（4）不同提取時間對紫薯花青素得率的影響。固定氯化膽堿與檸檬酸摩爾比為1∶2，在料液比為1∶10，含水量為20%，溫度為60℃，提取時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h，計算紫薯花青素得率，確定提取效果最佳的時間。

（5）不同提取溫度對紫薯花青素得率的影響。固定氯化膽堿與檸檬酸摩爾比為1∶2，在料液比為1∶10，含水量為20%，提取時間為2 h，提取溫度分別為20，30，40，50，60，70，80℃時，計算紫薯花青素得率。考查20~80℃溫度變化范圍內(nèi)，不同溫度變化因素對紫薯花青素提取的影響。

1.3.6 正交試驗

在單因素試驗的基礎上優(yōu)化試驗結果，選取提取工藝條件摩爾比、含水量、溫度和提取時間進行L9（34），探討該4個因素及其不同水平對紫薯中花青素提取的影響。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 DES種類對紫薯花青素得率的影響

提取溶劑對提取效果起關鍵作用，不同氫鍵供體的類型是影響DESs密度、表面張力和黏度等物理化學性質的因素，也對目標成分的提取有重要影響[19]。以氯化膽堿為HBA，并選擇不一樣的HBD，加熱攪拌后制備DES。比較不同的HBD的DES對花青素得率的影響，制備4種不同的DES，花青素得率的大小依次為檸檬酸>葡萄糖>蔗糖>尿素。因此，最終確定氯化膽堿-檸檬酸為最佳提取溶劑，作為后續(xù)的試驗條件。

不同低共熔溶劑對紫薯花青素的提取率見圖1。

圖1 不同低共熔溶劑對紫薯花青素的提取率

2.1.2 低共熔溶劑體系的摩爾比對紫薯花青素得率的影響

摩爾比對紫薯花青素提取率的影響見圖2。

圖2 摩爾比對紫薯花青素提取率的影響

由圖2可知，隨HBA-HBD摩爾比的增大，得率也在提高，在HBA-HBD摩爾比為1∶2時達到最大值，在更高的摩爾比時，得率反而下降?？赡苁且驗槟柋葹?∶2的DES具有更低的黏度和表面張力，提高了傳質率，使提取溶劑更易去滲透和促進溶出紫薯中的花青素。因此，確定氯化膽堿（HBA）/1,4-丁二醇（HBD）摩爾比為1∶3的DES為最佳比例的提取溶劑，作為后續(xù)的試驗條件。

2.1.3 提取含水量的影響

含水量對紫薯花青素提取的影響見圖3。

由圖3可知，隨著DES含水量的增多，花青素的得率不斷上升，當DES含水量為20%時，花青素提取率為0.937 mg/g，達到最高；含水量超過25%后，花青素得率開始下降。這可能是因為含水量影響DES的極性和黏度，水的加入使DES的黏度降低和極性增加，但是過量的水反而會抑制成分間的相互作用，因此確定DES最佳含水量為20%作為后續(xù)的試驗條件。

圖3 含水量對紫薯花青素提取的影響

2.1.4 提取時間的影響

提取時間對紫薯花青素提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對紫薯花青素提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的延長，紫薯花青素的得率升高，當提取時間達到2.5 h后，紫薯花青素得率達到最大，且不再增加反而出現(xiàn)降低。這可能是因為隨著提取時間的增加，使DES充分滲透于紫薯顆粒中，促使目標物質溶出，使花青素得率提高。而進一步延長萃取時間可能會導致目標化合物的分解或者是發(fā)生其他的化學反應。因此，確定2.5 h為最佳提取時間。

2.1.5 提取溫度的影響

提取溫度對紫薯花青素提取的影響見圖5。

圖5 提取溫度對紫薯花青素提取的影響

由圖5可知，隨著提取溫度在一定范圍內(nèi)的不斷升高，紫薯花青素得率呈上升趨勢。當提取溫度到達60℃時，得率到達最高，隨后得率隨提取溫度的升高反而降落。這可能是因為升高溫度會導致DES的黏度、表面張力和極性降低，有利于花青素的溶出，升高溫度會加快分子的活動，加快目標物質擴散。但過高的溫度將會導致花青素發(fā)生如水解、氧化等反應，從而降低得率。因此，確定提取溫度為60℃。

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果分析見表5。

表5 正交試驗結果分析

由表5可知，提取過程中含水量和提取溫度這2個因素對紫甘薯中花青素的提取效果影響較大，低共熔溶劑的摩爾比和提取時間這2個因素的影響效果較小，因素影響順序為B>C>D>A。即含水量>提取溫度>提取時間>摩爾比，提取過程中含水量和提取溫度對紫薯中花青素提取效果影響較大，低共熔溶劑的摩爾比和提取時間的影響較小。最佳提取組合為A2B3C3D3，即含水量25%，摩爾比1∶2.0的氯化膽堿-檸檬酸體系為提取劑，料液比為1∶10，提取溫度80℃，提取時間3.0 h為紫薯花青素最佳提取條件，此時花青素的提取率達1.086±0.022 mg/g。

3 結論

紫薯中富含花青素，采用低共熔溶劑作為溶劑，以紫薯花青素得率為指標，采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化紫薯花青素的提取工藝。選用摩爾比為1∶2.0的氯化膽堿-檸檬酸制備低共熔溶劑，取得當?shù)凸踩廴軇┖繛?5%，料液比1∶10，提取溫度80℃，提取時間3.0 h時，花青素得率可達1.086±0.022 mg/g的結果。該方法工藝條件溫和，不需要高溫高壓，花青素的提取率較高，水解和生物分解損失率低。該研究結果表明低共熔溶劑可作為提取紫薯中花青素的有效提取溶劑。