周怡，闕敏，王新靜

(安徽省婦女兒童保健中心新生兒疾病篩查科，安徽 合肥 230061)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)為苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)基因突變導致常染色體隱性遺傳病，多誘使肝臟PAH活性缺失或者降低，在我國發(fā)病率約為1/11 000[1]。PKU會嚴重影響兒童腦組織發(fā)育，未接受及時治療會導致患兒出現(xiàn)語言、智力及運動功能障礙，且不可逆[2]。PKU按照血液中苯丙氨酸水平可以分為經典型、中間型以及輕型，其中近90%為經典型。不同國家、地區(qū)基因突變存在差異，因此不同地區(qū)基因突變特點存在差異[3]。PAH為發(fā)揮催化作用四聚體，可以將機體肝臟苯丙氨酸催化為酪氨酸，PAH基因存在12個內含子及13個外顯子編碼，其中外顯子7與PAH酶活性功能關系密切[4]。因此，PAH基因外顯子7突變種類、分布及特點在PKU患兒診斷發(fā)揮重要作用，也可以為患兒PAH基因突變具體機制的研究奠定基礎。本研究通過采用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性(single strand Cconformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products，PCR-SSCP)及序列技術對PKU患兒進行檢測，旨在明確PAH基因外顯子7突變特點及其與臨床的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2020年12月安徽省婦女兒童保健中心中心診治的87例PKU患兒為研究對象。其中男性49例，女性38例；年齡0.7～7歲，平均(4.13±1.64)歲；依據(jù)苯丙氨酸水平分型：輕型(<600 μmol/L)8例，中間型(600～1 200 μmol/L)13例，經典型(>1 200 μmol/L)66例。納入標準：(1)參照《高苯丙氨酸血癥診治共識》(2014年)中對應標準[5]進行診斷；(2)均接受了血二氫蝶啶還原酶、尿蝶呤譜、四氫生物蝶呤負荷試驗；(3)初診時苯丙氨酸水平超過120 μmol/L；(4)年齡0.7～7歲；(5)患兒研究參與獲得其家屬知情同意，研究進行符合《赫爾辛基宣言》中倫理學標準。排除標準：(1)酪氨酸血癥、四氫生物蝶呤缺乏癥、一過性高苯丙氨酸血癥患者；(2)近期服用影響苯丙氨酸藥物；(3)在入組前已經行對癥治療者；(4)存在心臟、肝腎、肺部等機體重要器官功能異常者。

1.2 方法

收集3 mL靜脈全血，置于抗凝試管中待測。(1)DNA提?。簯肣IAamp DNA Blood Mini Kit(德國Qiagen公司)抽提，DNA抽提濃度可以通過增加洗脫次數(shù)并延長高溫孵育時間提高，獲得基因DNA用1%瓊脂糖電泳予以鑒定，將其置于-20 ℃保存待測。(2)PCR擴增：采用C1000 Touch型號PCR儀(美國Bio-Rad公司)完成。反應體系：1×緩沖液、dNTP、正向引物、反向引物、Taq酶、擴增反應模板、雙蒸水體積分別為3、1、1、1、1、1、17 μL。PCR反應測定應用；反應條件：95 ℃預變性5 min→95 ℃變性45 s→60 ℃退火60 s→72 ℃變性45 s，30個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，隨后將其溫度降至4 ℃。應用1%瓊脂糖電泳檢測擴增PCR產物，將擴增產物置于-80 ℃冰箱保存待測。(3)DNA序列以及突變位點測定：應用PCR產物直接測序法進行檢測，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司負責樣品純化以及序列檢測，測序獲得PAH基因DNA結果需要與基因庫中對應結果予以比對，并依據(jù)基因庫中結果確定外顯子7突變情況。(4)基因型與PKU表型分析：依據(jù)Guldberg等[6]提出評分方式評估突變基因人為值(assigning value，AV)，其值與突變基因性質關系密切，AV值為1時表示存在突變，而殘余酶活性范圍低于10%、10%～30%、30%～70%及70%以上AV值分別賦分1、2、4、8分，最后將突變等位基因評分AV數(shù)值相加。依據(jù)AV數(shù)值之和預測患兒PKU表型，其中AV值之和為2、3～8及9以上分別表示為經典型、中間型及輕型PKU。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析與處理。計數(shù)資料[n(%)]表示；基因型與PKU表型的預測價值應用Kappa檢驗。

2 結果

2.1 患兒PAH基因外顯子7位點突變情況

87例患兒一共存在174個等位基因，最終檢出6種PAH基因外顯子7位點突變，其基因型分別為R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V。見圖1。

2.2 患兒PAH基因外顯子7位點突變頻率

87例患兒中，40例外顯子7位點突變中檢出1種基因突變，其中R243Q基因突變32例，IVS7+2T-A基因突變6例，R241C基因突變2例；4例中檢出2種基因突變，其中R243Q/IVS7+2T-A基因突變1例，R241C/G247V基因突變1例，G247R/L255S基因突變2例。R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V基因突變頻率分別為18.97%、4.02%、1.72%、1.15%、1.15%、0.57%。見表1。

表1 患兒PAH基因外顯子7位點突變頻率[n(%)]

2.3 患兒PAH基因外顯子7位點突變情況與表型的關系

經典型PKU患兒檢出6種突變，中間型PKU檢出R243Q、IVS7+2T-A、R241C三種突變，而輕型PKU僅檢出R243Q突變。見表2。

表2 患兒PAH基因外顯子7位點突變情況與表型的關系[n(%)]

2.4 患兒基因型-表型預測分析

應用外顯子7位點突變情況預測患兒PKU表型，經典型、中間型及輕型PKU預測與臨床診斷一致性較高，Kappa值分別為0.818、0.781、0.935。見表3。

表3 患兒基因型-表型預測分析

3 討論

PKU主要由PAH基因突變所致，PAH基因主要由位于編碼位置13個外顯子及位于非編碼位置12個內含子構成，可以發(fā)揮轉錄mRNA及翻譯氨基酸作用。PAH基因亞基變化均會導致酶功能及結構變化，對應編碼位置基因變化會進一步導致PAH功能降低或者缺失，進而使機體出現(xiàn)相應臨床表現(xiàn)[7-8]。PAH基因外顯子7主要存在于PAH酶催化區(qū)域，該區(qū)域存在氨基酸殘基情況與活性位點關系密切，氨基酸堿基變化誘使PAH酶活性受到影響。因此，PAH基因外顯子7是PKU患者PAH基因突變重要分析部分[9-10]。

本研究在PKU患兒體內發(fā)現(xiàn)6種PAH基因外顯子7突變，分別為R243Q、IVS7+2T-A、R241C、G247R、L255S、G247V，6種基因突變頻率分別為18.97%、4.02%、1.72%、1.15%、1.15%、0.57%。有研究[11]顯示，84例患兒中共鑒定出159個PAH突變等位基因，包括100個錯義突變、28個剪切突變、24個無義突變和7個缺失突變，外顯子7突變頻率最高(32.08%)，其中p.R243Q的突變頻率最高，占全部突變的20.13%，與本研究結果一致。另一研究[12]顯示，PAH基因中最常見遺傳變異為c.1066-11G>A和c.143t>c，與任何單個外顯子相比，外顯子7攜帶遺傳變異最多，3例患者PAH基因第7、11外顯子c.727c>T/c.1066-11g>A雜合。本研究結果顯示，大部分患兒均檢出1種基因突變，且主要為R243Q基因突變，少部分患兒可以檢出2種基因突變。國內研究者[13]也發(fā)現(xiàn)，PKU患兒中檢出基因突變也為1種，且主要為第7號外顯子，但是也發(fā)現(xiàn)1例典型病例出現(xiàn)2個雜合基因突變，主要為p.S70del(缺失突變)c. 208-210delTCT(缺失突變)，與本研究中相關結果相似。另研究[14]者發(fā)現(xiàn)，70例PKU患兒中大部分為復合雜合變異，僅有3例為純合變異，原因可能是其研究中除檢測外顯子7號位點突變外，還檢測了其他各種外顯子以及內含子位點突變，但是本研究中僅檢測了外顯子7位點基因突變。對應基因型中變異位點相對溫和位點即剩余酶活性高位點在基因突變中發(fā)揮主導作用，即其在基因型表型形成發(fā)揮決定作用[15]。經典型PKU患兒檢出6種突變，中間型PKU檢出R243Q、IVS7+2T-A、R241C三種突變，而輕型PKU僅檢出R243Q突變，顯示PKU患兒PAH基因突變基因型與患者臨床表現(xiàn)存在相關性。本研究應用外顯子7位點突變情況預測患兒PKU表型，經典型、中間型以及輕型PKU預測與臨床診斷一致性較高，Kappa值分別為0.818、0.781、0.935，顯示PAH基因型與臨床診斷表型存在相關性，可用于患者臨床表型診斷。Wang等[16]研究中，35例患兒中檢出70個等位基因中鑒定出61個突變，頻率為87.14%，最常見突變?yōu)镽243Q(26.23%)、R241C(9.84%)和V399V(8.20%)，生化表型預測與臨床表型一致性為81.25%，其中經典PKU的一致性最高(87.50%)。

綜上，PKU患兒PAH基因外顯子7位點突變有6種類型，其突變類型主要為R243Q，患兒臨床表型與突變基因型存在相關性，突變基因型用于預測臨床表型價值優(yōu)異，可以為其后患兒診斷以及預后評價提供參考依據(jù)。但是基因突變容易受種族、地區(qū)等諸多因素影響，因此后期需要進一步擴大研究樣本量，明確不同種族以及地區(qū)對PKU患兒PAH基因突變影響。