劉琴，楊陳武，劉小燕，歐國春，陳小菊

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 南充 637000；2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610081；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像研究所，四川 南充 637000；4.遂寧市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 遂寧 629000)

S100A8是S100鈣結(jié)合蛋白家族主要成員之一，在中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等髓系細(xì)胞中高表達(dá)[1]。在炎癥反應(yīng)中，S100A8由活化的巨噬細(xì)胞分泌，再與巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或淋巴細(xì)胞結(jié)合后發(fā)揮抗炎作用[2]。S100A8能夠與脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)產(chǎn)生協(xié)同作用，放大LPS的促炎效應(yīng)[3]。肺泡巨噬細(xì)胞是參與肺部炎癥的重要細(xì)胞，S100A8呈劑量、時(shí)間依賴性刺激大鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)等炎癥介質(zhì)[4]。本研究擬探討S100A8 siRNA對脂多糖誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞釋放各炎癥介質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，S100A8 siRNA的構(gòu)建及引物合成由上海生物工程科技有限公司完成。Ham’s F-12K基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Procell，中國)，胎牛血清(HyClone，美國)，青霉素-鏈霉素雙抗(HyClone，美國)，LipofectamineTM2000(Invitrogen，美國)，脂多糖(Sigma，美國)，總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen，美國)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific，美國)，All-in-one qPCR Mix(GeneCopoeia，美國)，大鼠IL-6、IL-8和TNF-α ELISA試劑盒(NeoBioscience，中國)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) NR8383細(xì)胞用含15%胎牛血清的Ham’s F-12K培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染當(dāng)天取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用6 cm皿進(jìn)行細(xì)胞鋪板，鋪板細(xì)胞數(shù)為1.2×106個(gè)/6 cm皿，siRNA：LipofectamineTM2000=20 pmol：1.5 μL，轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000產(chǎn)品說明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染分S100A8沉默組和陰性對照組：S100A8沉默組為S100A8-Rat-52 siRNA組，陰性對照組為轉(zhuǎn)染無關(guān)序列siRNA組。轉(zhuǎn)染后24 h收集細(xì)胞，平行試驗(yàn)進(jìn)行3次。(1)S100A8-Rat-52 siRNA序列：正鏈：5’-GCAACGUCAUUGAAGUCUATT-3’；反鏈：5’-UAGACUUCAAUGACGUUGCTT-3’。(2)陰性對照siRNA序列：正鏈：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；反鏈：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.2.3 熒光定量PCR法檢測目的基因表達(dá)水平 用Trizol法在超凈環(huán)境中提取總RNA，均使用無菌無RNA酶器材。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR法對S100A8基因進(jìn)行擴(kuò)增，選擇GAPDH為內(nèi)參基因。大鼠S100A8基因引物序列：上游引物：5’-ACAGGGATGACTTCAGGAAAAT G-3’，下游引物：5’-CCACCCTTATCACCAACACAAG-3’，擴(kuò)增片段長度：147 bp。大鼠GAPDH基因引物序列：上游引物：5’-AAGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物：5’-TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG GTC-3’，擴(kuò)增片段長度：115 bp。

逆轉(zhuǎn)錄及PCR均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，每個(gè)基因均為3個(gè)復(fù)孔。逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)體系均為20 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃、60 min，70 ℃、5 min。優(yōu)化PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 10 min；變性95 ℃ 10 s，退火62 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 15 s；擴(kuò)增50個(gè)循環(huán)。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)水平。

1.2.4 LPS刺激轉(zhuǎn)染后細(xì)胞 分為S100A8沉默組和陰性對照(無關(guān)序列siRNA)組，siRNA片段成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，收集細(xì)胞并以1×105的密度接種24孔板，每孔500 μL。用LPS刺激細(xì)胞，按照LPS刺激濃度，分為4組，分別加入稀釋后的LPS至終濃度為10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mL、0 μg/mL，完成干預(yù)后細(xì)胞繼續(xù)放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)濃度均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。再繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，取出24孔板，分別收集以上各組細(xì)胞的上清液(4 ℃，1 500 rpm，離心5 min)，保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.5 細(xì)胞上清液中各細(xì)胞因子濃度的檢測 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-8和IL-6的濃度，實(shí)驗(yàn)按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過曲線求得各樣本的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率觀察

在倒置熒光顯微鏡下觀察，帶綠色熒光的細(xì)胞即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率=同一視野綠色熒光細(xì)胞數(shù)/白光下細(xì)胞總數(shù)。本實(shí)驗(yàn)用siRNA：LipofectamineTM2000=20 pmol：1.5 μL轉(zhuǎn)染NR8383細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率>80%。見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染后NR8383細(xì)胞S100A8基因的沉默效率

轉(zhuǎn)染24 h后檢測S100A8基因的相對表達(dá)，S100A8-Rat-52 siRNA沉默組S100A8基因相對表達(dá)量為0.136(沉默率86.4%)。見圖2。

2.3 不同濃度LPS刺激S100A8沉默組和陰性對照組細(xì)胞，上清液中炎癥介質(zhì)濃度的變化

增加LPS的刺激濃度，S100A8沉默組和陰性對照組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α濃度均逐漸增加，各濃度組與0 μg/mL的陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，各濃度組兩兩比較，差異也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、表2、表3和圖3。

表1 不同濃度LPS對S100A8沉默組和陰性對照組細(xì)胞分泌IL-6的影響

表2 不同濃度LPS對S100A8沉默組和陰性對照組細(xì)胞分泌IL-8的影響

表3 不同濃度LPS對S100A8沉默組和陰性對照組細(xì)胞分泌TNF-α的影響

以相同濃度LPS刺激S100A8沉默組和陰性對照組2 h，陰性對照組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α的濃度均高于S100A8沉默組細(xì)胞的，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

在急性或慢性炎癥反應(yīng)中，活化的巨噬細(xì)胞可主動分泌S100A8[5]，而細(xì)胞外的S100A8可以與單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面的葡聚糖結(jié)合，激活Toll樣受體4(toll-like receptors,TLR4)和晚期糖基化受體(receptors of advanced glycation endproducts，RAGE)等模式識別受體，繼而發(fā)揮促炎作用[6-7]。S100A8可以激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的依賴核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路，使得TNF-α的產(chǎn)生和分泌增多，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)[8]。

LPS是G-細(xì)菌細(xì)胞壁的主要組成部分，可作用于肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥介質(zhì)，是臨床上炎癥感染的主要因素[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，予以不同濃度LPS刺激大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383，隨著LPS濃度的增加，細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α濃度均逐漸增加，提示LPS對肺泡巨噬細(xì)胞NR8383的刺激呈濃度依賴性，這與既往的研究[10]類似。

另外，本研究進(jìn)一步成功沉默了NR8383細(xì)胞中的S100A8基因，再予以LPS刺激S100A8沉默組和陰性對照組細(xì)胞，陰性對照組細(xì)胞上清液中IL-6、IL-8和TNF-α濃度均高于S100A8沉默組，提示NR8383細(xì)胞中S100A8基因被沉默后，肺泡巨噬細(xì)胞受LPS刺激后釋放的炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8和TNF-α水平降低，這證實(shí)了脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與S100A8有著密切關(guān)系。LPS可能先誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生S100A8，S100A8再刺激其產(chǎn)生炎癥介質(zhì)。既往研究[11-12]已證實(shí)脂多糖可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生S100A8，而S100A8可直接刺激離體培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞分泌IL-6、IL-8和TNF-α增多[4]。

綜上，脂多糖呈濃度依賴性地刺激NR8383細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)IL-6、IL-8和TNF-α。LPS誘導(dǎo)的NR8383細(xì)胞內(nèi)S100A8基因的表達(dá)降低后，IL-6、IL-8和TNF-α等炎癥因子的水平也明顯降低，即脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與S100A8密切相關(guān)。