陳一言，陸阿明，齊亞楠，王 琳*，劉云逸

髕腱病是髕腱反復承受不合理的負荷導致的退行性變，在籃、足、排等需要反復跳躍的項目中患病率可達34%[1]。目前還沒有針對髕腱病的完善有效的預防或治療措施出現(xiàn)，這種現(xiàn)狀與對其發(fā)生機制不了解有關，因此，完善髕腱病的發(fā)病機制非常重要。

肌腱部位的代謝決定了其對外力負荷的病理和生理適應之間的均衡[2-4]，信號通路則在此時承擔橋梁的作用。p38促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）信號通路是細胞內(nèi)信息傳遞的主要信號通路之一，外力負荷下p38MAPK信號傳導通路把外部刺激傳至細胞內(nèi)部，從而調(diào)節(jié)生理生化反應[5-7]，應力刺激會影響p38MAPK在肌細胞、腱細胞、骨與軟骨中的活躍程度[8]。

髕腱起于髕尖，止于脛骨結(jié)節(jié)，髕腱病患者觸診最痛點為腱起止點[9-10]，大多數(shù)針對髕腱與骨結(jié)合部的研究只涉及髕骨髕腱結(jié)合部（PPTJ）。即使在相同的干預條件下，髕腱中不同部位的變化也不盡相同[11]，缺乏脛骨髕腱結(jié)合部（TPTJ）的研究則無法全面了解腱病中腱止點的發(fā)病機制。雖然肌腱附著點的損傷是由于持續(xù)收縮的肌肉不斷牽拉附著點而引起的一種慢性損傷，但是一次不適宜運動引起的急性損傷有可能成為腱病的起始原因[12-13]。本文通過電刺激定量跳躍裝置使兔進行一次性大強度跳躍負荷，研究在p38MAPK信號通路被抑制前后兔PPTJ與TPTJ的適應性變化有何不同，是否會使組織結(jié)構(gòu)分層相同的兩結(jié)合部之間產(chǎn)生差異。該研究旨在了解p38MAPK在腱病發(fā)展中的作用，豐富和完善髕腱發(fā)病機制，為運動中腱病預防提供理論指導。

1 研究方法

該方案經(jīng)北京體育大學運動科學實驗倫理委員會批準（批準號：2016013），實驗動物均在麻醉下進行所有手術，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。

1.1實驗對象與分組

14只18周齡雌性新西蘭大白兔（購買于北京興隆實驗動物養(yǎng)殖中心），隨機分為對照組（CON，N=4）、跳躍組（J1，N=5）、跳躍后注射p38抑制劑組（J1P，N=5）。溫度20~22℃，濕度55%~65%。常規(guī)飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2動物訓練方法

本研究采用的動物模型為在北京體育大學運動醫(yī)學實驗室建立的新西蘭大白兔大強度定量跳躍模型，該模型需要用到的儀器為：電刺激動物跳臺（DSTT-1）、激光發(fā)射接收器（ZL-QTJS002）[14]。牽引繩將兔前肢套起，跳躍前訓練人員提起繩索使兔前肢呈懸空姿態(tài)，后肢位于電刺激器上，與地面呈60°保持預備姿勢，兔騰空及落地過程中牽引繩處于不受力狀態(tài)。電壓15 V，電流1 min通5次，電刺激引發(fā)兔向前上方跳躍且每次跳躍后迅速將兔重置并重復這一過程。激光發(fā)射接收器固定跳臺2側(cè)，實時反饋跳躍高度。合格跳躍定義為兔以預備姿勢在電刺激的電流刺激下向正前方主動跳躍，高度不低于15 cm（該模型的大強度由兔的最低跳躍高度得出）[14]。實驗前所有訓練人員接受培訓。適應性訓練3 d，每天跳躍次數(shù)依次增加，分別為50次、100次、150次。訓練時安撫兔情緒。正式實驗：每日1次，每次150個合格跳躍。分10組完成，每組15次。組間休息3 min，為了控制跳躍質(zhì)量，第4組與第8組結(jié)束后，休息6 min。此舉是為了控制跳躍質(zhì)量，若不延長休息時間將無法完成后續(xù)訓練。CON組不訓練，J1P組于每次訓練后腹腔注射SB203580（0.5 mg/kg）。關于p38抑制劑的研究已比較完善，大量文獻證明，p38抑制劑SB203580在注射進實驗動物體內(nèi)可產(chǎn)生抑制效應[15]。

1.3樣品處理

完成相應訓練24 h后25%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射，兔固定在解剖臺上，沿兔后肢長軸剪開兔膝關節(jié)皮膚，取兔髕腱連同髕腱末端區(qū)附著的骨和軟骨，手術刀切分為PPTJ與TPTJ，10%福爾馬林溶液固定24 h，70%酒精保存。保存后的組織常規(guī)脫水（LeicaASP200S，德國）后石蠟包埋（Leica，德國），每一部位按橫截面一分為二待測，冷卻后冰箱4℃保存。隨后進行石蠟切片（LeicaRM2235，德國），切片厚度7 μm。每個蠟塊保證組織完整的15張切片，烤箱60℃烘烤2 h。

1.4組織染色

使用常規(guī)H&E染色（蘇木素與伊紅染色液G1140，G1110，購于Solarbio）與免疫組化（一抗比例1:100，bs-0812R，bs-6312R，bs-0086R，Bioss；試 劑 盒SP-0022，SP-0023，Bioss）處理。

1.5圖像采集

使用光學顯微圖像采集系統(tǒng)（50i，日本尼康）進行圖像采集。H&E在20倍、40倍視野下各拍攝1張，100倍3張，偏振光模式拍攝要求同上。免疫組化20倍視野1張，100倍3張，400倍5張。拍攝標準 統(tǒng)一，PPTJ髕尖朝左下方45°，100倍視野下骨區(qū)占畫面的三分之一；TPTJ髕腱與脛骨結(jié)合位置的長條形空隙一致橫向置于畫面中線并與上下底邊平行。存為TIF格式。

1.6測試指標

采用定性描述和相對定量分析2種方式。定性分析腱止點細胞的形態(tài)、膠原排列、潮線變化等組織學表現(xiàn)；定量（MetaMorph 7.7）分析纖維軟骨帶厚度、細胞密度與免疫組化陽性指標數(shù)（選取與p38及腱病聯(lián)系密切的相關因子，分別為IL-6、IL-1β、TGF-β1）。軟骨帶厚度與細胞密度在100倍視野下的3張照片測定后取平均值。免疫組化陽性指標在400倍下測定5張后取平均值。在肌腱對負荷的適應性過程中，炎性因子與纖維化因子是影響這一進程的兩大重要因素[16]。有研究認為白細胞介素（IL）是腱病的初始致病因子，也有實驗通過對急性運動后的組織活檢發(fā)現(xiàn)IL對腱病的上調(diào)作用被夸大[17]。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β1）是調(diào)節(jié)損傷愈合中纖維化進程的核心因子[18]，它可以調(diào)節(jié)膠原的生成并促進瘢痕形成與組織連續(xù)[19]。p38MAPK可以影響IL等炎性因子的產(chǎn)生，并能夠在TGF-β激活的蛋白激酶1結(jié)合蛋白（TAB1）的幫助下完成自身磷酸化過程[20]。

1.7統(tǒng)計學處理

測試結(jié)果用平均數(shù)±標準差（X±SD）描述。將干預手段（對照、跳躍、跳躍加抑制劑）作為自變量，使用單因素方差分析法分別對PPTJ和TPTJ進行定量指標分析，后續(xù)兩兩比較采用LSD方法；相同干預條件下的PPTJ與TPTJ 2個不同部位之間進行配對T檢驗。顯著性差異定義為P＜0.05。指標包括：細胞密度、軟骨帶厚度、免疫組化IL-6、IL-1β、TGF-β1陽性計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PPTJ與TPTJ的組織形態(tài)學定性描述

圖1 所示，CON-P為對照組PPTJ的H&E圖像，CON-P'是CON-P偏振光圖像，CON-T是對照組TPTJ的H&E圖 像，CON-T'是CON-T偏振 光 圖像，以此類推。

圖1 H&E染色顯微成像圖（放大倍數(shù)100×）Figure1 H&E staining microscopic image(magnification 100×)

PPTJ與TPTJ的CON組結(jié)果：肌腱細胞核均呈梭形，軟骨細胞核呈圓形，均無細胞核聚集現(xiàn)象，肌腱的膠原纖維整齊排列，纖維軟骨區(qū)靠近肌腱部位的軟骨細胞呈扁圓形，在靠近軟骨中央的地方細胞體積逐漸增大變?yōu)槁褕A形，骨區(qū)多橢圓形空腔，非鈣化的纖維軟骨、鈣化軟骨與骨之間分層清晰。TPTJ纖維軟骨區(qū)與鈣化的軟骨區(qū)之間可見一條清晰、平滑的圓弧形潮線，PPTJ未見潮線；TPTJ肌腱與軟骨細胞比PPTJ的肌腱與軟骨細胞排列更加緊湊，且TPTJ的卵圓形細胞核的面積略大于PPTJ，即TPTJ的軟骨區(qū)域比PPTJ多；偏振光圖像顯示，TPTJ比PPTJ膠原排列更致密。

J1組：以CON組為參照，PPTJ與TPTJ均產(chǎn)生了小范圍的細胞聚集現(xiàn)象，PPTJ細胞聚集情況的改變更明顯；PPTJ出現(xiàn)潮線，TPTJ潮線與CON組無明顯改變；此時二者潮線相比，TPTJ潮線更加清晰平滑；偏振光圖像顯示，2個部位未產(chǎn)生明顯的膠原形態(tài)改變。

J1P組：以J1組為參照，TPTJ潮線邊緣模糊且清晰度低于PPTJ潮線。

2.2指標定量分析

如表1所示，干預手段只對PPTJ的IL-6有顯著性影響（P=0.045），所以對該指標進行兩兩比較。

表1 干預手段對PPTJ與TPTJ指標單因素方差結(jié)果（X±SD）Table1 The results of single-factor variance of PPTJ and TPTJ indicators by intervention methods(X±SD)

圖2 結(jié)果顯示，J1P組PPTJ的IL-6含量明顯大于CON組（P=0.015）。

圖2 干預手段對PPTJ的IL-6影響兩兩比較結(jié)果（個/mm2）Figure2 Pairwise comparison of the intervention effects on IL-6 of PPTJ(pieces/mm2)

由表2可知，軟骨帶厚度在J1P組PPTJ明顯小于TPTJ（P＜0.05），其他時間點均無顯著性差異。

表2 PPTJ與TPTJ細胞密度與軟骨帶厚度的相對值比較（X±SD）Table2 Comparison of cell density and cartilage zone thickness between pptj and tptj(X±SD)

由表3可知，CON組中，PPTJ的IL-1β與IL-6明顯少于TPTJ（P＜0.05）；J1組PPTJ的IL-1β、TGF-β1、IL-6明顯少于TPTJ（P＜0.05）；J1P組中，PPTJ的IL-1β含量明顯少于TPTJ（P＜0.05）。

表3 PPTJ與TPTJ免疫組化指標的相對值比較（X±SD）Table3 Comparison of immunohistochemical indexes between PPTJ and TPTJ(X±SD)

3 討論

3.1大強度跳躍負荷下p38MAPK對兔髕腱起止點組織學影響

組織學上的“潮線”指的是未鈣化軟骨與鈣化軟骨的分界線，健康骨腱結(jié)合部的潮線通常呈現(xiàn)圓弧形，邊緣清晰，這種結(jié)構(gòu)可以幫助減少軟骨損傷[11]。在J1組中，一次大強度跳躍負荷使肌腱受應力刺激，細胞內(nèi)膠原和基質(zhì)的合成增加，新陳代謝增加，對PPTJ造成細胞核聚集、潮線形態(tài)改變、邊緣模糊與上漲等情況，對TPTJ僅造成細胞聚集的情況，由此可見，在一次性的大強度跳躍負荷下，PPTJ比TPTJ更脆弱，這可能與二者在健康情況下的組織學結(jié)構(gòu)有關，從CON組的實驗結(jié)果來看，健康情況下的TPTJ比PPTJ結(jié)構(gòu)更加致密。肌腱的波浪狀纖維結(jié)構(gòu)在受到外力刺激時，可以有效利用結(jié)構(gòu)優(yōu)勢進行緩沖，這種機制在一定程度內(nèi)可以避免肌腱因受力過大而產(chǎn)生損傷[21]，J1組偏振光結(jié)果顯示，PPTJ與TPTJ的膠原排列均無明顯變化，說明在這一點上二者均可以良好地適應。通過文獻檢索未發(fā)現(xiàn)一次運動與骨腱結(jié)合部相關的研究成果出現(xiàn)，因此本文將結(jié)合與肌腱或長期運動相關的研究成果進行討論。李敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)一次性中等強度跑臺運動會使鼠跟腱的膠原間隙增大、局部排列錯亂，與本文結(jié)果不一致，原因可能是部位不同或取材時間不同，李敏等[22]的研究取材時間為訓練后即刻，而本文的取材時間為訓練后24 h，或許可以說明一次急性運動后發(fā)生的微細結(jié)構(gòu)損傷可以在24 h內(nèi)逐漸恢復。

申晉波等[23]發(fā)現(xiàn)急性力竭運動使大鼠跟腱膠原排列紊亂、間隙增大，與本實驗結(jié)果不同，原因可能是取材部位的不同和其干預手段為力竭運動。在J1P組中，注射p38MAPK抑制劑使PPTJ的潮線更清晰，原本潮線更加清晰的TPTJ部位適應性能力降低。p38MAPK在運動過程中將力學因素傳遞到細胞內(nèi)，從而使相關細胞對該刺激進行生理生化調(diào)節(jié)反應，關于p38MAPK的研究 表明：p38MAPK信 號通路的抑制使得許多病理變化得到抑制，如細胞凋亡、炎性因子的產(chǎn)生及基質(zhì)分解酶的分解作用等[24]。本實驗結(jié)果提示，一次大強度跳躍負荷下，p38MAPK在2個結(jié)合部表達被激活且對PPTJ潮線表現(xiàn)有消極影響，對TPTJ潮線表現(xiàn)有積極影響。湯婷婷[25]研究發(fā)現(xiàn)2周與6周跳躍會使大鼠跟腱止點中p38表達顯著增加，與本研究結(jié)果類似。在損傷修復的早期，相關因子在修復的過程中會通過瘢痕形成來促進組織的連續(xù)性，同時也會激活軟骨細胞的增殖分化，導致細胞數(shù)量增多。只有持續(xù)不斷的負荷有效地激活了以上進程，才會使腱止點的細胞密度增加，這是組織在損傷早期對應力負荷導致細微損傷所做出的適應性反應[26]。本實驗條件下未對細胞密度產(chǎn)生統(tǒng)計學影響，可見在一次大強度跳躍刺激下，p38MAPK激活與否對髕腱起止點細胞的增殖分化未起明顯作用。腱止點的纖維軟骨帶厚度常常被用來評價該部位的損傷愈合與恢復情況。纖維軟骨帶厚度的增加往往是因為此處受到反復的應力刺激導致纖維軟骨細胞增多，骨與肌腱之間接觸面更大，使應力有所分散，且隨著跳躍負荷的積累和訓練時間的延長，活躍的軟骨細胞會合成更多的基質(zhì)，增強抗拉力[27]。

本研究結(jié)果顯示，實驗干預手段未使PPTJ或TPTJ各自的軟骨帶厚度產(chǎn)生明顯變化。梁孝天等[28]發(fā)現(xiàn)4周的跳躍訓練會使兔PPTJ細胞密度與軟骨帶厚度顯著增加，與本文結(jié)果不符，這可能是因為本實驗干預時間短。雖然本實驗干預未使2個結(jié)合部各自的軟骨帶厚度明顯增加，但使二者之間的軟骨帶厚度差值發(fā)生了顯著變化。健康的PPTJ與TPTJ之間軟骨帶厚度不存在顯著性差異，一次大強度跳躍負荷也未明顯地使二者軟骨帶厚度產(chǎn)生顯著性差異，p38MAPK表達被抑制后，TPTJ的軟骨帶厚度顯著大于PPTJ。該結(jié)果提示，一次大強度跳躍負荷下，p38MAPK信號通路被激活并影響PPTJ與TPTJ軟骨帶厚度差異，使二者的抗拉能力拉開差距。

3.2大強度跳躍負荷下p38MAPK對兔髕腱起止點相關因子含量影響

在腱病發(fā)展過程中，早期是否存在炎癥反應及其作用尚不清楚，炎性病變能否被認為是腱病的原因目前尚無定論。IL-1β常被認為是炎癥反應的核心，它影響細胞外基質(zhì)降解，調(diào)節(jié)炎性介質(zhì)IL-6、COX-2、PGE2的生成，調(diào)控膠原生成并促進彈性蛋白生成，改變肌腱細胞的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)[29]。TGF-β1則是纖維化反應的核心因子，它與肌腱的力學性能息息相關。在本實驗中，只有PPTJ的IL-6含量在其適應性進程中有顯著改變，J1P組明顯大于CON組。Astill等[30]發(fā)現(xiàn)急性抗組運動后3~4 h肌腱中IL-6含量顯著上升，與本文結(jié)果不符的原因可能是測定時間不同，或許說明一次急性運動后IL-6的變化可以逐漸恢復。申晉波等[23]發(fā)現(xiàn)急性力竭運動過程中大鼠跟腱TGF-β1表達過高，與本研究結(jié)果不符，可能是因為其實驗條件為力竭運動。CON組結(jié)果說明在健康的PPTJ與TPTJ中，PPTJ中的IL-1β、IL-6含量明顯少于TPTJ，而TGF-β1的含量無明顯差異，即這2個部位相關的炎性反應能力存在差異，而纖維化性能在健康狀態(tài)下并沒有存在明顯差距。跳躍與抑制并沒有改變2個結(jié)合部中IL-1β含量的差異，但改變了其他2個細胞因子的結(jié)果。J1組，2個部位TGF-β1含量開始有明顯差值，具體表現(xiàn)為PPTJ的TGF-β1含量明顯少于TPTJ，可知一次大強度跳躍負荷使PPTJ與TPTJ之間TGF-β1含量差值顯著增加。注射抑制劑后2個部位TGF-β1與IL-6含量的顯著性差異消失，該種現(xiàn)象提示p38MAPK在一次大強度跳躍負荷下會對PPTJ與TPTJ之間TGF-β1、IL-6含量的差異產(chǎn)生影響[31]。

3.3大強度跳躍負荷下p38MAPK與兔髕腱起止點適應性反應的關系

通過本實驗中的結(jié)果可知，在一次大強度跳躍負荷下，PPTJ的適應性能力弱于TPTJ，這可能是健康情況下的PPTJ無論從細胞密度還是膠原纖維的排列緊密程度都低于TPTJ，并且IL-1β、IL-6這2個炎性因子在2個部位中的原始表達量有較大差異，導致炎癥反應機能有一定差異。將組織學表現(xiàn)與細胞因子結(jié)果結(jié)合分析，J1組大強度跳躍負荷對2個結(jié)合部均造成微細結(jié)構(gòu)紊亂現(xiàn)象，TPTJ紊亂程度低于PPTJ，與此同時，2個部位的TGF-β1含量開始產(chǎn)生差異，TPTJ明顯大于PPTJ，意味著此時這2個部位的纖維化進程已經(jīng)產(chǎn)生差距[32]，可以認為TPTJ此時的高TGF-β1表達對其適應性進程有積極作用。注射抑制劑后PPTJ中IL-6相比CON組顯著提高，2個部位中TGF-β1、IL-6含量差異消失，軟骨帶厚度差值明顯增大，且此時原本適應能力更強的TPTJ在組織學上的表現(xiàn)差于PPTJ。軟骨帶厚度增加有時被看作是一種正面的適應性反應，但在本實驗J1P組中，組織學上TPTJ表現(xiàn)更差，推測在J1P組中，TPTJ軟骨帶厚度明顯大于PPTJ并不能被認為是PPTJ正面的適應性反應，反而會減弱整個骨腱結(jié)合部區(qū)域的組織柔韌性與肌腱的抗牽拉能力[33-34]。該結(jié)果提示，一次大強度跳躍負荷下，抑制p38MAPK會使原本TPTJ優(yōu)于PPTJ的現(xiàn)象扭轉(zhuǎn)。

一次大強度跳躍負荷下，p38MAPK會對PPTJ與TPTJ的適應性反應產(chǎn)生影響，抑制前TPTJ優(yōu)于PPTJ，抑制后情況發(fā)生反轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果顯示，p38在腱病發(fā)展過程中的作用值得進一步研究，以形成成熟的研究成果運用于實際運動中。使用p38抑制劑在特定時間段對特定部位進行干預，從而降低腱病發(fā)展的可能性或推遲腱病發(fā)展過程中的時間節(jié)點。

4 結(jié)論

4.1一次大強度跳躍負荷會引起PPTJ與TPTJ微細結(jié)構(gòu)變化（TPTJ的微細結(jié)構(gòu)變化優(yōu)于PPTJ）并使PPTJ與TPTJ之 間TGF-β1差 值 顯 著 增 大，p38MAPK被抑制后結(jié)局相反。

4.2一次大強度跳躍負荷下，p38MAPK的活化會維持PPTJ中IL-6含量的穩(wěn)定，p38MAPK被抑制使PPTJ與TPTJ之間IL-6含量顯著性差異消失。