魯素雅，邢海艷，吳義春，金鵬

（淮安市食品藥品檢驗所，淮安 223005)

防曬類化妝品因具有保護人體皮膚免受紫外線輻射損傷的功效而受到廣大消費者的青睞，其主要活性成分為防曬劑。防曬劑是指利用光的吸收、反射或散射作用，以保護皮膚免受特定紫外線所帶來的傷害或為保護產(chǎn)品本身而在化妝品中加入的物質(zhì)。按防曬機制不同，防曬劑可分為物理防曬劑和化學(xué)防曬劑兩類。防曬劑對皮膚有保護作用，但是使用過量也會影響皮膚健康，如過敏、泛紅、光敏、發(fā)炎等［1-4］?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》 2015 年版（簡稱《技術(shù)規(guī)范》）中規(guī)定了27 種準用防曬劑，其中包括2 種物理防曬劑和25 種化學(xué)防曬劑［5-6］。二苯甲酮類化合物是一類具有紫外吸收功能的高分子材料，其吸收波長范圍廣，同時具有防長波紫外線（UVA）和中波紫外線（UVB）的功能，是目前國內(nèi)外常用的防曬劑。但二苯甲酮類也是環(huán)境激素，會干擾生物體和人體內(nèi)分泌，造成精子數(shù)量減少，并導(dǎo)致不孕癥等不良反應(yīng)［7-10］，因此《技術(shù)規(guī)范》中明確規(guī)定了可作為防曬劑使用的品種和最大使用濃度，其中二苯酮-3、二苯酮-4／5 是準用防曬劑，最大使用濃度分別為10%和5%，二苯酮-5 是二苯酮-4 的鈉鹽形式，實際使用以二苯酮-4 計算，并且僅規(guī)定了二苯酮-2的檢測方法并用于此類化合物的檢測與監(jiān)管，而對化妝品中其它二苯甲酮類化合物含量的測定則未作規(guī)定，因此不利于對此類化合物的監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量控制［11］。

高效液相色譜（HPLC）法是化妝品檢驗中較常使用的方法，其檢測范圍廣，對樣品要求較低，對極性和非極性化合物均能達到有效的分離。唐娜等［12］采用高效液相色譜法測定了化妝品中山梨酸和脫氫乙酸；肖庚鵬等［13］采用柱前衍生-高效液相色譜法測定了化妝品中?；撬幔魂愳o等［14］采用高效液相色譜法同時測定了化妝品中8 種防腐劑；楊淡梅等［15］采用高效液相色譜法同時了檢測染發(fā)類化妝品中16 種禁用著色劑。筆者通過對樣品處理及HPLC條件進行了優(yōu)化，建立了同時測定化妝品中9 種二苯甲酮類紫外吸收劑的高效液相色譜法，為市場監(jiān)管與檢測提供數(shù)據(jù)與方法支撐。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters 2695／2998 型，美國沃特世公司。

超聲清洗儀：KQ-250DV 型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水機：美國密理博公司。

有機系針筒式微孔濾膜：0.45 μm，上海安譜公司。

電子天平：XS205D 型，感量為0.01 mg，美國梅特勒公司。

甲醇、乙腈、四氫呋喃：均為色譜純，德國默克公司。

高氯酸：分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司?；瘖y品樣品：共15 批，市購。

二苯甲酮類標準物質(zhì)：基本信息見表1。

表1 二苯甲酮類標準物質(zhì)基本信息

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×2.1mm，5 μm，美國沃特世公司）；流動相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表2；流量：1.0 mL／min，進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：322 nm。

表2 流動相梯度洗脫程序

1.3 溶液配制

9 種二苯甲酮標準溶液：1.0 mg／mL，分別稱取9 種二苯甲酮類標準物質(zhì)（BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-6、BP-7、BP-8、BP-10、BP-12）各10 mg（精確至0.01 mg），分別置于9 只10 mL 容量瓶中，分別加入乙腈溶解并稀釋至標線，混勻。

9 種二苯甲酮混合標準溶液：分別移取BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 標 準 溶 液 各2.5 mL，BP-4、BP-7、BP-8 標準溶液各5.0 mL，置于同一只100 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標線，混勻，配制成BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 的質(zhì)量濃度均為25 μg／mL，BP-4、BP-7、BP-8 的質(zhì)量濃度均為50 μg／mL 的混合標準溶液。

9 種二苯甲酮系列混合標準溶液：依次移取9種二苯甲酮混合標準溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，分別置于6 只10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋至標線，混勻，配制成BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 的質(zhì)量濃度均分別為0.25、0.5、1.25、2.5、5、12.5 μg／mL，BP-4、BP-7、BP-8 的質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、2.5、5、10、25 μg／mL 的系列混合標準溶液。

1.4 樣品處理

稱取樣品約1.0 g，置于50 mL 具塞試管中，加入30 mL 乙腈，超聲提取30 min，冷卻，用乙腈稀釋至50 mL，混勻，靜置，過濾，取續(xù)濾液作為樣品溶液，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑選擇

稱取3 份陰性樣品，各1.0 g，分別加入1.3 中的9 種二苯甲酮混合標準溶液5 mL，分別選取乙腈、四氫呋喃、甲醇-四氫呋喃-水-高氯酸混合溶劑（體積比為250∶450∶300∶0.2）為提取溶劑，按照1.4方法處理樣品，在1.2 儀器工作條件下進樣測定，計算不同溶劑提取時9 種二苯甲酮的回收率，結(jié)果見表3。由表3 可知，以乙腈為提取溶劑時，樣品的回收率較高，重復(fù)性好；用四氫呋喃為提取溶劑時，各組分回收率均偏低；采用混合溶劑提取時測定結(jié)果重復(fù)性較差，故選取乙腈作為提取溶劑。

表3 不同溶劑提取時9 種二苯甲酮的回收率 %

2.2 取樣量選擇

分別稱取陰性樣品0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g，各加入1.3 中的9 種二苯甲酮混合標準溶液5 mL，按照1.4 方法處理樣品，在1.2 儀器工作條件下進樣測定，比較不同取樣量時樣品的加標回收率，結(jié)果見表4。

表4 不同取樣量時9 種二苯甲酮的回收率 %

由表4 可知，不同取樣量對分析結(jié)果影響不明顯。采用IBM SPSS Statistics 22 統(tǒng)計軟件對檢測結(jié)果進行配對樣本t檢驗［16］，t值均大于0.05，故不同取樣量對樣品提取回收率的影響無統(tǒng)計學(xué)差異（t≥0.05）。由于化妝品基質(zhì)較復(fù)雜，為避免由于取樣量太少使化合物檢測量小于檢出限，或取樣量過大污染儀器與色譜柱，選擇取樣量為1.0 g。若樣品中化合物檢出濃度超出標準曲線線性范圍可適當稀釋后再檢測。

2.3 色譜條件

2.3.1 色譜柱選擇

分別比較Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、資 生 堂Capcell PAK C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、資 生 堂Capcell PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、資生堂Capcell PAK CR柱（150 mm×2.0 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）5 種不同型號的色譜柱對9 種二苯酮類紫外吸收劑的分離效果。結(jié)果表明，C8色譜柱不能將9 種化合物有效分離；使用CR色譜柱分離時，前8種化合物出峰時間比較密集；采用C18色譜柱時，9 種化合物均能有效分離，其中采用Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）分離時，峰型尖銳，各化合物響應(yīng)較高，故選取Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）對9 種二苯酮類紫外吸收劑進行分離。

2.3.2 流動相選擇

分別選擇乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水作為流動相對9 種二苯甲酮混合標準溶液進行梯度洗脫，在1.2 儀器工作條件下進樣測定，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，由于甲醇洗脫能力小于乙腈，各組分出峰較晚且集中，以乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸溶液作為流動相時，二苯酮-4／5 峰型不尖銳，與以乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時相比保留時間變化較大。結(jié)合3組流動相梯度洗脫出峰情況及使用乙腈作提取溶劑，最終選擇乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

圖1 不同流動相時9 種二苯甲酮混合標準溶液色譜圖

2.3.3 檢測波長選擇

分別考察了9 種二苯酮類紫外吸收劑在210～400 nm 的特征吸收峰分布情況。結(jié)果顯示，9種二苯酮類化合物在210～350 nm 紫外波長范圍內(nèi)均有特征吸收，其中二苯酮-4 和二苯酮-7 的響應(yīng)較低，故選擇二苯酮-4 和二苯酮-7 響應(yīng)相對較高的322 nm 作為檢測波長。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

分別稱取防曬噴霧、防曬霜、隔離霜、粉底液4種空白基質(zhì)樣品各1.0 g，按照1.4 樣品處理方法，分別制備防曬噴霧、防曬霜、隔離霜、粉底液空白基質(zhì)溶液，分別加入1.3 中的9 種二苯甲酮混合標準溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL 配制成基質(zhì)標準溶液，在1.2 儀器工作條件下進樣測定，以二苯甲酮的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，以對應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性方程。以4 種基質(zhì)標準曲線方程的斜率（k1）與用乙腈配制的標準溶液繪制的標準曲線斜率（k2）進行比較，斜率的比值見表5。

表5 基質(zhì)標準曲線斜率與乙腈配制標準曲線斜率的比值

由表5 可知，測定的斜率比值為0.985～1.068，說明該提取方法對4 種不同基質(zhì)提取后，基質(zhì)效應(yīng)較小，可直接采用乙腈配制標準溶液進行定量分析。

2.5 線性方程、檢出限與定量限

在1.2 儀器工作條件下，對1.3 中的9 種二苯甲酮系列混合標準溶液進樣測定，以二苯甲酮的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，以對應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

另取陰性樣品1.0 g，分別加入不同濃度的9 種二苯甲酮混合標準溶液，按照1.4 方法處理樣品，在1.2 儀器工作條件下進行測定，以3 倍信噪比（S／N）對應(yīng)的二苯甲酮的含量為檢出限，以10 倍信噪比對應(yīng)的二苯甲酮的含量為定量限。9 種二苯甲酮類紫外吸收劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表6。

表6 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 加標回收與精密度試驗

取陰性樣品1.0 g，分別加1.3 中的9 種二苯甲酮混合標準溶液0.5、1.0、5.0 mL，按1.4 方法處理樣品，制備成3 個不同濃度水平的加標樣品溶液，每個濃度點平行制備6 份，在1.2 儀器工作條件下進行測定，結(jié)果見表7。

表7 加標回收與精密度試驗結(jié)果

續(xù)表7

由表7 可知，9 種二苯甲酮類紫外吸收劑的加標回收率為89.84%～112.04%，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.2%～7.7%，表明該方法具有良好的準確度和精密度。

2.7 實際樣品測定

按所建方法，對市售的15 批化妝品樣品進行測定，結(jié)果見表9。由表9 可知，有2 批樣品檢出二苯酮-3，含量分別為1.53%和5.95%，未超出10%的使用限度；有1 批樣品檢出禁用物質(zhì)二苯酮-10，含量為12.6 μg／g。在15 批樣品中均未發(fā)現(xiàn)有干擾目標物測定的雜質(zhì)峰。代表性的防曬霜樣品的色譜圖如圖2 所示，從圖中可知，化妝品中基質(zhì)未干擾目標物的測定。

表9 種化妝品中二苯酮類紫外吸收劑檢測結(jié)果

圖2 防曬霜樣品色譜圖

3 結(jié)語

建立了化妝品中9 種二苯甲酮類紫外吸收劑同時測定的高效液相色譜法。以乙腈為溶劑，對樣品進行超聲提取，以C18色譜柱將目標物分離，用二極管陣列檢測器檢測。該方法流動相配制簡便，準確度高，分離效果好，基質(zhì)干擾少，滿足化妝品中多種二苯甲酮類紫外吸收劑同時測定。