于姍姍，王云，李敏，張秋紅

（濟(jì)南市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，濟(jì)南 250102）

槐枝為常用中藥，最早收載于《別錄》，《新修本草》中又名嫩槐枝，為豆科植物槐的嫩枝，具有散瘀止血，清熱燥濕，祛風(fēng)殺蟲之功效，主治崩漏、赤白帶下、痔瘡、陰囊濕癢、心痛、目赤、疥癬等，每年4～5月采收，曬干或鮮用?？杉鍦⒔苹驘覂?nèi)服，亦可煎水熏洗、燒瀝涂［1］。

槐枝含有較多的黃酮類化合物，臨床上常用于治療咽炎、中耳炎、膿皰瘡等［2-4］，其中蘆丁為主要藥效成分。蘆丁又稱蕓香苷，是一種存在于多種植物中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，因此用蘆丁含量作為測定槐枝的質(zhì)量控制指標(biāo)具有重要意義。

槐枝在歷版國家標(biāo)準(zhǔn)、《山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》及《山東省中藥飲片炮制規(guī)范》中均未收載，在部分省級標(biāo)準(zhǔn)中有收載。但是檢驗(yàn)項(xiàng)目及內(nèi)容比較單一，有的地方標(biāo)準(zhǔn)中無檢驗(yàn)項(xiàng)目［5-9］，有的地方標(biāo)準(zhǔn)中檢驗(yàn)項(xiàng)目有性狀、顯微鑒別、薄層鑒別及常規(guī)的藥材檢查項(xiàng)目［10-11］。上述標(biāo)準(zhǔn)中均無含量測定方法，《遼寧省中藥材標(biāo)準(zhǔn)：第二冊》2019 年版中薄層鑒別前處理方法復(fù)雜，展開劑用到易制毒試劑丁酮，因此優(yōu)化槐枝的薄層色譜鑒別方法及建立高效液相色譜法測定蘆丁含量具有重要意義。

目前文獻(xiàn)中對槐枝的質(zhì)量評價(jià)多采用其高麗槐素、蘆丁、槲皮素以及揮發(fā)油的含量作為評價(jià)指標(biāo)。但成麗等［12］采用高效液相色譜法測定槐枝中高麗槐素含量，方法重現(xiàn)性好，但是因?yàn)楦啕惢彼貙φ掌分苽浞爆?，不利于廣泛普及。陳華國等［13］采用高效液相色譜法同時(shí)測定槐枝中蘆丁和槲皮素含量，以甲醇-0.01 mol／L 乙酸銨(體積比為47∶53)混合溶液為流動(dòng)相，流動(dòng)相中需要加入鹽溶液，配制比較復(fù)雜，操作不當(dāng)容易阻塞色譜柱，損壞高效液相色譜儀。熊維政等［14］利用高效液相色譜法測定國槐槐枝及槐葉中蘆丁含量，并進(jìn)行了比較，采用的流動(dòng)相配制簡便，但是樣品提取過程中沒有考察溶劑的影響，不能精準(zhǔn)地測定槐枝中蘆丁含量。趙超等［15］以蘆丁為對照品，利用分光光度法測定槐枝中總黃酮類含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品處理過程繁瑣，操作復(fù)雜。張艷焱等［16］采用水蒸汽蒸餾法分別提取新鮮和干燥槐枝中的揮發(fā)油，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析和鑒定其化學(xué)成分，方法對儀器及操作者水平要求較高，不適用于槐枝的日常檢驗(yàn)。

筆者收集了10 批槐枝飲片樣品，以蘆丁含量為評價(jià)指標(biāo)，對樣品提取條件、薄層色譜展開劑、色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了槐枝的薄層色譜鑒別法及高效液相色譜法測定其中蘆丁含量的方法。該方法操作簡單、分離度好、經(jīng)濟(jì)環(huán)保，準(zhǔn)確度高，為槐枝質(zhì)量控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立奠定了研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AT 型，LCsolution 工作站，島津企業(yè)管理（中國）有限公司公司。

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-600GDV 型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速萬能粉碎機(jī)：FW100 型，天津市泰斯特儀有限公司。

電子天平：MS204TS 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

蘆丁對照品：批號為100080-201811，含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為91.7%，中國食品藥品檢定研究院。

硅膠G 薄層板，青島海洋化工廠分廠。

甲醇：色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰尽?/p>

冰醋酸：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

槐枝飲片樣品：10 批，編號分別為1～10，均為豆科植物槐Sophora japonica L.的嫩枝，經(jīng)干燥，切片制得，產(chǎn)地均為山東。其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

1.2 薄層色譜鑒別

1.2.1 對照品溶液制備

取蘆丁對照品適量，加入甲醇溶解，配制成蘆丁的質(zhì)量濃度為2 mg／mL 的對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液制備稱取2 g 槐枝粉末（過二號篩，篩孔直徑為2 000 μm），加入30 mL 石油醚（30～60 ℃）超聲處理（500 W，頻率40 kHz）20 min，過濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50 mL 甲醇超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，取濾液蒸干，殘?jiān)尤? mL 甲醇溶解，所得溶液即為供試品溶液。

1.3 高效液相色譜法測定

1.3.1 色譜條件

色 譜 柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，瑞典諾力昂公司）；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸溶液（體積比為32∶68）；檢測波長：257 nm；流量：1.0 mL／min；柱溫：36 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.2 對照品溶液制備

精密稱取蘆丁對照品0.102 82 g，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻，過濾，取續(xù)濾液2 mL，置于250 mL 容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成蘆丁的質(zhì)量濃度為15.1 μg／mL 的對照品溶液。

1.3.3 供試品溶液制備

精密稱取槐枝粉末（過二號篩）約0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，密塞，稱量并記錄質(zhì)量，超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，再次稱量質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 薄層色譜鑒別條件選擇

按照《中國藥典》2020 年版［17］槐米的薄層鑒別方法，選擇1 號槐枝樣品粉末（過二號篩）2 g，加入50 mL 甲醇超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，取濾液蒸干，殘?jiān)尤? mL 甲醇溶解，作為供試品溶液。按1.2.1 方法制備對照品溶液。按照薄層色譜法（2020 年版《中國藥典：四部》 通則0502）試驗(yàn)方法，分別吸取供試品溶液和對照品溶液各2 μL和5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為8∶1∶1）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置于紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可以看出，供試品色譜圖中，沿著展開過程，有明顯的未完全分離的熒光斑條，在與對照品色譜圖相應(yīng)的位置上，有相應(yīng)的未分離完全的熒光斑點(diǎn)，點(diǎn)樣量2 μL 及5 μL 無明顯區(qū)別，結(jié)果表明，供試品色譜圖中，雖然含有蘆丁，但是因?yàn)闃悠冯s質(zhì)較多，提取條件或展開劑選擇不恰當(dāng)，導(dǎo)致斑點(diǎn)未完全分離。

圖1 槐枝的薄層色譜圖

考慮到槐枝樣品中含有色素等極性較大的物質(zhì)較多，先對樣品進(jìn)行脫色處理。稱取3 份槐枝粉末（過二號篩）樣品，各2 g，分別加入石油醚（30～60℃）、石油醚（60～90 ℃）、乙醚各30 mL，分別超聲處理20 min；再稱取3 份槐枝粉末（過二號篩）樣品，各2 g，分別加入石油醚（30～60 ℃）、石油醚（60～90℃）、乙醚各30 mL，分別回流提取20 min，將處理后的6 份樣品分別過濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50 mL 甲醇超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，取濾液蒸干，加入2 mL 甲醇使殘?jiān)芙猓频? 份供試品溶液。以乙酸乙酯-甲醇-水（體積比為8∶1∶1）溶液為展開劑，考察不同提取溶劑及提取方法的展開效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以石油醚（30～60℃）、超聲處理20 min 展開結(jié)果最好，供試品色譜圖在與對照品色譜圖相應(yīng)位置上，能顯示出相同顏色的斑點(diǎn)，但是斑點(diǎn)有拖尾。在展開劑中加入少量甲酸，斑點(diǎn)分離效果好，無拖尾現(xiàn)象，故樣品提取方法選擇先加入石油醚（30～60 ℃），超聲處理20 min，然后加入50 mL 甲醇提取，展開劑選擇乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（體積比為8∶1∶1∶1）溶液。

2.2 薄層色譜鑒別結(jié)果

根據(jù)2.1 薄層色譜鑒別條件，建立槐枝的薄層色譜鑒別方法：稱取槐枝粉末（過二號篩）2 g，加入石油醚（30～60 ℃）30 mL 超聲處理20 min，過濾，棄去濾液，濾渣揮干溶劑后，加入50 mL 甲醇超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，過濾，取濾液蒸干，加入2 mL 甲醇溶解殘?jiān)?，即為供試品溶液。?.2.1 方法制備對照品溶液。按照薄層色譜法（2020年版《中國藥典：四部》 通則 0502）試驗(yàn)方法，分別吸取供試品溶液和對照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（體積比為8∶1∶1∶1）溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴三氯化鋁試液，待乙醇揮干后，置于紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看出，供試品色譜圖在與對照品色譜圖相應(yīng)位置上，呈現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

圖2 槐枝的薄層色譜圖

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別精密吸取1.3.2 中的對照品溶液和1.3.3 中的供試品溶液，各10 μL，按1.3.1 色譜條件測定，理論板數(shù)按蘆丁色譜峰計(jì)不低于3 000，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)符合要求。對照品溶液、供試品溶液色譜圖如圖3 所示。

圖3 對照品溶液、供試品溶液的色譜圖

2.4 蘆丁含量測定提取條件選擇

選擇編號為1＃的槐枝樣品粉末，分別選擇甲醇、70%乙醇溶液、50%甲醇溶液及50%乙醇溶液4 種提取溶劑對蘆丁進(jìn)行提取，考察不同提取溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以50%甲醇溶液為提取溶劑時(shí)，色譜峰面積最大，基線平穩(wěn)，故采用50%甲醇為提取溶劑。以50%甲醇溶液為提取溶劑，分別采用超聲法（30、60 min）、回流法（30、60 min）對蘆丁進(jìn)行提取，考察不同提取方法的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取（30、60 min）及回流提取（30、60 min）的色譜峰面積無明顯差異，故選用超聲法（30 min）對樣品進(jìn)行提取。

2.5 色譜條件優(yōu)化

分別選用瑞典Nouryon 的Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱、島津企業(yè)管理（中國）有限公司的VP-ODS C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱及美國安捷倫科技有限公司的Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同色譜柱之間無明顯差異，均能實(shí)現(xiàn)色譜分離，理論板數(shù)，分離度及拖尾因子均符合《中國藥典》2020 年版的規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)選用瑞 典Nouryon 的Kromasil 100-5-C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)色譜柱作為分離柱。

在1.3.1 色譜條件下，分別考察了甲醇-0.01 mol／L 乙酸銨(體積比為47∶53)溶液、甲醇-1%冰醋酸（體積比為32∶68）溶液、乙腈-2.5%冰醋酸（體積比為13∶87）溶液3 種流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-2.5%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，色譜圖中的溶劑峰明顯；采用甲醇-0.01 mol／L 乙酸銨溶液、甲醇-1%冰醋酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，蘆丁的色譜峰尖銳，理論板數(shù)高，分離度良好。由于甲醇-0.01 mol／L 乙酸銨溶液配制較復(fù)雜，使用鹽溶液操作不當(dāng)容易阻塞色譜柱，損壞高效液相色譜儀，而甲醇-1%冰醋酸溶液配制簡單，操作容易。綜合考慮，選擇甲醇-1%冰醋酸（體積比為32∶68）溶液為流動(dòng)相。

2.6 線性方程與檢出限

自動(dòng)進(jìn)樣器分別精密吸取1.3.2 中的對照品溶液3、7、10、13、15 μL 注入液相色譜儀，在1.3.1 色譜條件下，依次進(jìn)樣測定，以蘆丁的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

用甲醇將對照品溶液稀釋10 倍，然后逐級稀釋進(jìn)樣分析，以3 倍信號和噪音的比值（S／N）對應(yīng)的質(zhì)量作為方法檢出限，5 倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量作為定量限。蘆丁的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表1。

表1 蘆丁的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

選擇1 號槐枝樣品粉末（過二號篩），精密稱取約0.5 g，按照1.3.3 方法制備供試品溶液，在1.3.1色譜條件下，分別于制備完成后第0、1、2、3、5、7、10、12、24 h 進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。由表2 可知，在24 h 內(nèi)色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 精密度試驗(yàn)

取1 號槐枝樣品粉末（過二號篩）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，按照1.3.3 方法制備供試品溶液，在1.3.1 色譜條件下分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。由表3 可知，色譜峰面積測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，表明該方法精密度較好，滿足測定要求。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取1 號槐枝樣品粉末（過二號篩）6 份，每份約0.25 g，分別加入質(zhì)量濃度為7.54 μg／mL的蘆丁對照品溶液20 mL，再精密加入25 mL 水和5 mL 甲醇，密塞，稱量并記錄溶液質(zhì)量，超聲處理（500 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻，再次稱量溶液質(zhì)量，用50%甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，在1.3.1 色譜條件下分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見表4。由表4 可知，樣品加標(biāo)回收率為98.7%～102.2%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)際樣品測定

分別精密稱取1～10 號槐枝樣品粉末（過二號篩），各約0.5 g，按1.3.3 方法制備供試品溶液，在1.3.1 色譜條件下分別進(jìn)樣測定，結(jié)果見表5。

表5 槐枝樣品蘆丁含量測定結(jié)果 %

由表5 可知，10 批槐枝樣品中蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.10%～0.16%之間。不同槐枝樣品之間蘆丁含量差異較大，可能是在槐枝采集過程中，存在以老枝摻入嫩枝入藥的情形，而老枝中蘆丁的含量較低。

3 結(jié)語

樣品先加石油醚（30～60 ℃）脫色，然后用甲醇進(jìn)行提取，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（體積比為8∶1∶1∶1）為展開劑，顯色后斑點(diǎn)清晰，分離度好，可用于槐枝的定性鑒別。采用50%甲醇作為提取溶劑，以甲醇-1%冰醋酸溶液（體積比為32∶68）為流動(dòng)相，建立了高效液相色譜法測定槐枝中蘆丁含量的方法。該方法簡便易行、準(zhǔn)確可靠，可為槐枝質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。