張愛利，耿志霞，韓冬

(山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山西 太原 030024)

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)是一種原因不明、慢性進行性纖維化性的間質(zhì)性肺病[1]，以慢性炎癥損傷及肺間質(zhì)過度纖維沉積為特征。肺纖維化發(fā)病率不斷上升[2]，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，目前臨床尚無特效治療方法。近年來中醫(yī)藥在肺間質(zhì)纖維化實驗研究中具有獨特的優(yōu)勢，并顯示出明確的作用靶點[3]。本研究采用博萊霉素復制大鼠肺纖維化模型，探討益肺通絡湯拮抗肺纖維化的作用機制。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，所選動物均購置于山西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 藥品及儀器

主要藥物：注射用博萊霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20055883)、醋酸潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：170219)、3.5%水合氯醛、20%烏拉坦溶液。益肺通絡湯(方藥組成：蛤蚧1對，紫河車粉10 g，黃芪30 g，五味子10 g，麥冬20 g，瓜蔞20 g，地龍10 g，蜂房10 g，全蝎6 g)，由山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供，山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室代煎濃縮成1 mL含生藥量2 g的藥液。主要儀器：AT-858型自動酶標分析儀(上海安泰分析儀器有限公司)、KDC-1044低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)、分析天平(北京Sartorius BL121SS)、Lumino化學發(fā)光免疫分析儀(深圳新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學工程有限公司)、羥脯氨酸(HYP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)試劑盒、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)試劑盒及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(上海江萊生物有限公司)。

1.3 分組及造模

清潔級雄性SD大鼠60只，采用簡單隨機數(shù)字表法，分為空白對照組(空白組)、模型組、潑尼松對照組(潑尼松組)、益肺通絡湯組(中藥組)，每組15只。空白組不進行造模，其余3組以3.5%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，麻醉生效后將其仰臥固定于手術板上，剪去頸毛，皮膚常規(guī)消毒，無菌操作下作長約1 cm的頸中切口，鈍性分離后充分暴露氣管，用1 mL注射器在環(huán)狀軟骨間隙部位刺入氣管腔，向氣管內(nèi)滴注博萊霉素5 mg/kg，完畢后將大鼠直立、旋轉(zhuǎn)，使藥物在大鼠肺內(nèi)分布均勻，縫合皮膚，局部消毒防止感染，動物清醒后置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。造模后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、行動緩慢、皮毛色暗無光澤、飲食減少、呼吸急促、口鼻有分泌物，提示造模成功。

1.4 給藥方法

造模成功后各組均于術后第2天開始灌胃給藥，劑量如下?？瞻捉M：每日給予2 mL蒸餾水；模型組：每日給予2 mL蒸餾水；潑尼松組：每日予醋酸潑尼松片混懸液灌胃，按體質(zhì)量3 mg/kg給藥；中藥組：灌服益肺通絡湯溶液，按生藥材計算每日給藥劑量(20 g/kg)，轉(zhuǎn)換為大鼠的等效劑量為3.5 mL/kg，相當于臨床用量的7.5倍。4組均為每天給藥1次，連續(xù)給藥28 d。

1.5 標本采集

造模28 d給藥結(jié)束后，稱重，20%烏拉坦溶液(5 mL/kg)腹腔注射麻醉后固定到大鼠解剖臺，打開腹腔，腹主動脈取血3 mL，將其靜置于4 ℃冰箱2 h，取出后3 000 r/min，離心20 min，將其血清置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測。將肺臟組織完整取出，在生理鹽水中快速洗去血液，用分析天平稱重，計算臟器指數(shù)。肺組織HYP含量檢測：對肺組織進行勻漿處理，標本勻漿后3 000 r/min離心10 min，取上清液于凍存管中并置于液氮罐保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 觀察指標

肺臟系數(shù)計算方法：肺臟系數(shù)=肺濕重(mg)/體質(zhì)量(g)×100%。測定肺組織HYP含量：按照試劑盒說明書檢測HYP含量。TGF-β1和bFGF及TNF-α：采用酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)測定各組大鼠血清TGF-β1和bFGF及TNF-α的含量。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

空白組大鼠狀態(tài)良好，活潑喜動，皮毛光澤鮮亮，呼吸飲食正常，口、耳、鼻無異常分泌物。模型組精神萎靡，行動緩慢，皮毛色暗無光澤，飲食減少，呼吸急促，口鼻有分泌物。潑尼松組活動量減少，皮毛少澤，口、耳、鼻分泌物量少，狀態(tài)略好于模型組。中藥組大鼠皮毛光澤欠佳，飲食正常，呼吸平穩(wěn)，口、耳、鼻無異常分泌物。四組均無異常死亡。

2.2 對肺損傷大鼠肺組織的影響

2.2.1 對大鼠肺臟系數(shù)影響

肺臟系數(shù)越大，說明肺纖維化程度越明顯。與空白組比較，模型組肺臟系數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，潑尼松組、中藥組肺臟系數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與潑尼松組比較，中藥組肺臟系數(shù)無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

2.2.2 對大鼠肺組織HYP含量的影響

肺組織HYP含量可以直觀地反映機體肺組織膠原代謝的情況。實驗結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組肺組織HYP值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較，中藥組肺組織HYP值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與潑尼松組比較，中藥組肺組織HYP值降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠肺臟系數(shù)及肺組織HYP含量的比較

2.3 各組大鼠血清TGF-β1和bFGF及TNF-α水平比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中TGF-β1和bFGF及TNF-α明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，潑尼松組、中藥組大鼠血清中TGF-β1和TNF-α及bFGF明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與潑尼松組比較，中藥組大鼠血清中TGF-β1和TNF-α及bFGF降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠血清TGF-β1和bFGF及TNF-α水平比較

3 討 論

肺間質(zhì)纖維化是臨床常見病，是一種慢性進行性的復雜疾病。臨床研究[4]表明，肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生是一個多因素過程，常伴有細胞因子、生長因子、炎癥介質(zhì)及趨化因子等活性物質(zhì)的參與。TGF-β1可上調(diào)膠原和纖維黏連蛋白的表達水平，使細胞外基質(zhì)合成并沉積，尤其在損傷愈合時，TGF-β1的上述作用更加明顯，導致肺纖維化的形成[5]。bFGF可以促進成纖維細胞增生和膠原纖維合成，對調(diào)控肺成纖維細胞分裂、增殖及膠原蛋白的合成與降解起重要作用[6]。有資料[7]表明，bFGF是一種致纖維化細胞因子，參與組織的修復和纖維化，在多種器官的纖維化中發(fā)揮作用。TNF-α是肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要因子，尤其是在肺損傷期的高度表達激發(fā)了其他致纖維化細胞因子的活性[8]。羥脯氨酸主要存在于膠原蛋白中，膠原是細胞外基質(zhì)中最豐富的結(jié)構(gòu)蛋白。肺組織中HYP含量是肺纖維化程度的重要標志。中醫(yī)中無肺纖維化病名，臨床根據(jù)其癥狀表現(xiàn)特點歸屬于中醫(yī)學“咳喘”“肺痹”“肺痿”范疇，病位在于肺，與脾、腎存在緊密的聯(lián)系[9]。多為本虛標實之證，肺腎虧虛為本，瘀痰阻絡為標。外邪侵襲，肺失宣肅，水道不通，積聚成痰；肺氣虧虛，氣運不暢，氣不行血，血液停滯而形成淤血；痰淤膠結(jié)，痹阻肺絡，肺氣損傷，日久病及于腎，最終導致肺腎虧虛、痰淤阻于肺絡。這與肺纖維化彌漫性肺泡炎、肺泡結(jié)構(gòu)紊亂、成纖維細胞過度增殖、細胞外基質(zhì)過度沉積等病理變化過程相一致[10]。益肺通絡湯由蛤蚧、紫河車粉、黃芪、麥冬、五味子、瓜蔞、地龍、蜂房、全蝎組成，適用于肺腎兩虛、痰淤阻絡型肺痹?？v觀全方，蛤蚧補肺益腎、納氣定喘，現(xiàn)代研究表明其還有抗缺氧、抗炎等功效；紫河車粉具有溫腎補精、益氣養(yǎng)血的功效，可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，提高機體免疫細胞活性與數(shù)量[11]；黃芪入脾肺二經(jīng)，補益肺脾之氣；麥冬滋肺腎之陰；五味子可斂肺、滋腎、生津、澀精，常用于肺虛喘咳[12]；瓜蔞具有清肺化痰、抗菌之功效；蜂房清熱散結(jié)、消腫止痛，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用[13]；地龍具有平喘通絡功效；全蝎可化瘀通絡、攻毒散結(jié)。諸藥攻補兼施，共同起到補肺益腎、化痰祛瘀、通絡平喘的功效，在臨床應用中取得了較好的療效。實驗結(jié)果顯示益肺通絡湯對肺纖維化大鼠血清TGF-β1，bFGF，TNF-α和肺臟系數(shù)及肺組織HYP含量有明顯降低作用，從而有效治療肺纖維化，其機制可能與降低肺部炎癥因子水平和抑制HYP膠原蛋白的表達有關，為臨床治療肺纖維化提供新的思路。