段利利，張 嬋，李志斌，楊 紅，王 林△，趙依芳

（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.婦產(chǎn)科；2.門診部，西安 710032；3.西北婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710003）

宮頸癌是全球女性第二大常見婦科癌癥[1]，準(zhǔn)確診斷是預(yù)防宮頸癌的第一步。傳統(tǒng)宮頸巴氏涂片及液積細(xì)胞學(xué)篩查已經(jīng)大大降低了宮頸癌的發(fā)病率，但其重復(fù)性和敏感性有限[2]。近紅外熒光（NIRF）成像作為一種新的癌癥檢測手段，在癌癥病理信息獲取方面表現(xiàn)出巨大潛力[3-5]，但該技術(shù)所要求的近紅外熒光探針需具備優(yōu)良的光學(xué)特性、合適的生物相容性和腫瘤靶向能力[6]。IR-783菁染料能夠選擇性地聚集在腫瘤部位，是一種理想的近紅外熒光探針[7]。為了探索IR-783在宮頸癌中的臨床應(yīng)用價值，本研究觀察不同環(huán)境下癌細(xì)胞對IR-783菁染料的攝取，并探討癌細(xì)胞中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽差異表達(dá)的潛在機(jī)制，為宮頸癌的診斷方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 IR-783 染料 IR-783 染料購自美國Sigma-Aldrich 公司（#115970-66-6），溶于稀釋的二甲基亞砜（DMSO），經(jīng)0.2 μm 過濾器過濾后保存在4 ℃冰箱中待用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa 和Caski和人正常永生化宮頸上皮細(xì)胞（H8）均購自中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫（上海），采用含5%胎牛血清、青—霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液并置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[8]。

1.3 細(xì)胞攝取IR-783染料 以細(xì)胞接種于涂有vitronectin（Na-lgenNunc）的四腔玻片上，在含有5%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。除去培養(yǎng)基后，將載玻片在37 ℃下的IR-783染料（20μm）的工作溶液中培養(yǎng)30 min，PBS 清洗兩次；4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗，用玻璃蓋玻片覆蓋載玻片和水性安裝介質(zhì)（Sigma-Aldrich）。用熒光顯微鏡（Olympus）記錄圖像，觀察細(xì)胞的染色結(jié)果。

1.4 宮頸癌組織近紅外成像 收集2020年1—3月在本院接受治療的3例宮頸癌患者的宮頸癌組織及其癌旁組織，進(jìn)行體外組織直接IR-783染色。所有樣本均用IVIS Lumina Ⅱ成像站（卡鉗生命科學(xué)）進(jìn)行NIRF成像，在共聚焦顯微鏡下采集圖像，然后將所有標(biāo)本固定，包埋，10μm 切片，行DAPI 染色，共焦顯微鏡分析其NIRF信號。

1.5 IR-783染料在活體小鼠腫瘤中的攝取和積累 氯胺酮（75 mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠，100 μL的HeLa 細(xì)胞懸液（1×107個/mL）接種至裸鼠皮下（n=6），每日觀察小鼠成瘤情況、飲食及精神狀態(tài)。待腫瘤直徑2～8 mm時，皮下注射IR-783（0.35 mg/kg）染料。通過X 射線和觸診進(jìn)行評估。注射24 h之后，乙醚麻醉小鼠，用柯達(dá)4 000 mm 成像站24 h后檢測全身熒光并拍照。隨后，脫頸處死裸鼠，剝離瘤體，4%多聚甲醛固定過夜。經(jīng)30%蔗糖溶液脫水，OCT包埋組織，放置在-80 ℃冰箱中用于行組織病理學(xué)觀察。該項目經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.6 IR-783 染料在宮頸癌細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位評價 為了測定線粒體和溶酶體對染料的攝取，根據(jù)說明書分別使用Mito Tracker Orange CMTMRos（#M7510）和Lyso Tracker Green DND-26（#L7526，分子探針，加利福尼亞州卡馬里羅市，美國）追蹤細(xì)胞質(zhì)線粒體和溶酶體。最后，在共焦顯微鏡（OLYMPUS FV1000）下觀察線粒體和溶酶體細(xì)胞染色結(jié)果。其中，DND-26 的發(fā)射/激發(fā)波長為554 nm/576 nm，CMTMRos的發(fā)射/激發(fā)波長為504 nm/511 nm。

為了分析有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)肽（OATP）在宮頸癌細(xì)胞IR-783染料攝取和積累中的作用，本研究中將宮頸癌細(xì)胞與不同的OATP抑制劑共孵育5 min，包括燕麥溴磺酞競爭性抑制物磺溴酞鈉（sulfobromophthalein，BSP，250 μmol/L，上海生工生物）、OATP1 抑制劑利福平（rifampicin，RIF；20 μmol/L，Sigma-Aldrich）、選擇性O(shè)ATP1B1 抑制劑17β-雌二醇（17β-estradiol，EST；20μmol/L，Sigma-Aldrich）和選擇性O(shè)ATP3B3抑制劑八肽膽囊收縮素（cholecystokinin octapeptide，CCK-8；20 μmol/L，上海生工生物）。隨后，再采用IR-783染料孵育細(xì)胞，在共焦顯微鏡下觀察（OLYMPUS FV1000）細(xì)胞的成像結(jié)果。

1.7 人血液標(biāo)本中宮頸癌細(xì)胞的檢測 為研究IR-783染料在宮頸癌細(xì)胞經(jīng)全身循環(huán)向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移時能否檢測到宮頸癌細(xì)胞，本研究中收集納入患者的血液樣本，將人血標(biāo)本與經(jīng)DAPI 預(yù)標(biāo)記的宮頸癌細(xì)胞信號細(xì)胞懸液混合，再加入IR-783 染料（20μmol/L），在37 ℃下培養(yǎng)30 min 后，用Histopaque-1077（#Histopaque，Sigma-Aldrich）梯度離心法從混合物中分離出單核細(xì)胞和癌細(xì)胞，對血液細(xì)胞中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測。將正常細(xì)胞和癌細(xì)胞固定后，在共聚焦顯微鏡下觀察混合物，通過陽性染色鑒定癌細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)用于計算血液中癌細(xì)胞總數(shù)。

1.8 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）收集宮頸癌細(xì)胞樣本，根據(jù)Trizol 試劑說明書提取細(xì)胞樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green 試劑在ABI 7500 PCR 儀（ThermoFisher Scientific Ltd，UK）對目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件：94 ℃30 s；94 ℃15 s，63 ℃20 s，72 ℃20 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量[9]。引物序列如下：OATP1，正向：5’-AGAGGGTAGATTGTTTTCC-3’，反向：5’-TGTGTTCGGTTCTCCATA-3’；OATP1B1，正向：5’-ACTGATTCTCGATGGGTTGG-3’，反向：5’-TTTCCAGCACATGCAAAGAC-3’；OATP1B3，正向：5’-TAATTTGGACATGCAAGACAATG-3’，反向：5’-AGTGAAAGACCAGGAACACCTC-3’；OATP4A1，正向：5’-CGTCACCTACCTGGATGAGAA-3’，反向：5’-AGATATTCAGCAGGGCACCTC-3’；OATP5A1，正向：5’-GGGTCCTATGGGTTGACCTT-3’，反向：5’-CCCTGTTGGGTTTTTGTGAT-3’；GAPDH，正向：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，反向：5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用Newman-Keuls 多重比較進(jìn)行事后檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人宮頸癌細(xì)胞對IR-783染料的特異性攝取 為明確IR-783 細(xì)胞對宮頸癌細(xì)胞攝取特異性，本研究將IR-783染料與人宮頸上皮細(xì)胞H8和人宮頸癌HeLa、SiHa 和Caski 細(xì)胞共孵育并對細(xì)胞中IR-783的攝取情況進(jìn)行了評估，結(jié)果表明IR-783被宮頸癌細(xì)胞系顯著而均勻地吸收，而正常細(xì)胞則沒有（圖1A），提示IR-783能夠被宮頸癌細(xì)胞特異性的攝取。用線粒體和溶酶體示蹤染料追蹤IR-783 的亞細(xì)胞定位顯示，IR-783（紅色）在細(xì)胞中的定位與線粒體（黃色）和溶酶體（綠色）存在明顯重合，表明IR-783定位于線粒體（圖1B）和溶酶體（圖1C）。

圖1 人宮頸癌細(xì)胞特異性攝取IR-783染料

2.2 IR-783 染料對人宮頸癌細(xì)胞異種移植瘤的成像 為了觀察異種宮頸腫瘤在體內(nèi)對IR-783 的攝取和保留的相似特異性，將IR-783 染料注入HeLa腫瘤小鼠皮下。時間研究表明，在給藥24 h 后，腫瘤中明確檢測到陽性顯像（圖2A）。然后，冰凍切片顯示細(xì)胞簇呈IR-783 染色陽性進(jìn)一步證實IR-783被宮頸癌細(xì)胞特異性攝取。此外，HE 染色也證實了宮頸癌細(xì)胞的存在（圖2B）。

圖2 IR-783染料在人宮頸腫瘤異種移植及代謝途徑檢測中的應(yīng)用

2.3 人宮頸腫瘤的體外IR-783 染料成像 為了評估患者宮頸腫瘤中是否可以檢測到IR-783染料，我們檢查了人類宮頸癌手術(shù)標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)與正常標(biāo)本相比，腫瘤組織中可以檢測到更高的染色（圖3A）。進(jìn)一步的冰凍切片分析顯示，宮頸癌中的IR-783染色的宮頸癌組織能夠檢測到明顯的近紅外熒光信號（圖3B）。這些數(shù)據(jù)表明，IR-783染料可以被臨床上的宮頸腫瘤攝取。

圖3 IR-783對新鮮解剖的人頸部腫瘤的染色成像

2.4 人血液中循環(huán)宮頸腫瘤細(xì)胞的檢測 同時，本也明顯檢測到癌細(xì)胞（圖4B）。血液混合1 000 和10 000個宮頸癌細(xì)胞組的流式檢測腫瘤細(xì)胞數(shù)量比血液中混合100 個宮頸癌細(xì)胞組顯著增加（均P＜0.001）（圖4C）。研究對IR-783 染料在宮頸癌細(xì)胞經(jīng)全身循環(huán)向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移時能否檢測到宮頸癌細(xì)胞的能力進(jìn)行評估。熒光分析顯示，血液中的癌細(xì)胞可以在敏感信號中顯示出來，并與單核細(xì)胞明顯區(qū)分（圖4A）。流式細(xì)胞儀分析表明，即使使用低細(xì)胞數(shù)，血液中

圖4 IR-783染料對人血液中宮頸癌細(xì)胞的抑制作用

2.5 宮頸癌細(xì)胞對IR-783 染料的選擇性攝取依賴于OATP1B3 和OATP1 的功能 為進(jìn)一步明確IR-783 被腫瘤細(xì)胞特異性攝取的分子機(jī)制，本研究中對OATPs 亞型在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，OATP1、OATP1B1、OATP1B3、OATP4A1和OATP5A1 等亞基均在宮頸癌細(xì)胞中有所表達(dá)。其中，OATP1、OATP1B1和OATP1B3在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)較正常細(xì)胞顯著上調(diào)，而OATP4A1 和OATP5A1 在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)與正常細(xì)胞無明顯差異（圖5A）。BSP 作為一種非特異性O(shè)ATP，誘導(dǎo)NIRF 信號下降最快，與對照組相比有明顯差異（P＜0.001）。CCK-8 和RIF，與對照組相比，陽性信號也顯著降低（P＜0.001）。然而，EST 作為一種選擇性的OATP1B1抑制劑，與對照組相比對信號幾乎沒有影響（圖5B和5C）。這些結(jié)果表明，NIRF染料的選擇性攝取主要依賴于OATP1B3和OATP1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

圖5 宮頸癌細(xì)胞對IR-783染料的選擇性攝取依賴于OATP1B3和OATP1的功能

3 討論

人乳頭狀瘤病毒（HPV）細(xì)胞學(xué)檢測及宮頸液積細(xì)胞學(xué)已被推薦為臨床宮頸癌篩查的方法，可顯著降低80%～90%的宮頸鱗狀細(xì)胞癌的死亡率[10]。因其缺乏特異性而無法區(qū)分常見的暫時性感染和罕見的流行性癌前病變，因此探索一種更有效的宮頸癌細(xì)胞成像方法勢在必行[11]。IR-783是一種七甲川吲哚菁染料，特異性極高，在腎癌研究和腫瘤檢測中的應(yīng)用早已被臨床認(rèn)可，但在宮頸癌中的應(yīng)用目前臨床尚無研究報道。

本研究結(jié)果顯示，IR-783 在體外和體內(nèi)都被宮頸癌細(xì)胞特異性地攝取，而正常細(xì)胞則不具有這種作用，提示IR-783在宮頸癌細(xì)胞中具有極高的特異性，有助于宮頸癌的鑒別診斷[12]。此外，IR-783可直接用于檢測血液或組織中的癌細(xì)胞，這在識別臨床標(biāo)本中的異質(zhì)性宮頸癌細(xì)胞方面具有獨特的優(yōu)勢[13]。表面標(biāo)記，如p16檢測分型標(biāo)記，是提高高靈敏度和高特異性相結(jié)合檢測宮頸癌的另一種策略，但已被證明具有較低的特異性和較低的敏感性[14]。

碳菁染料被惡性細(xì)胞特異性攝取的機(jī)制仍有待闡明。據(jù)報告研究，IR-783 和MHI-148 的攝取可由OATP 家族的跨膜蛋白介導(dǎo)[15]。先前的研究表明，燕麥多糖的抑制作用極大地抑制了NIRF 染料的攝取[11-12]，然而，到底哪一種OATPs在宮頸癌中起關(guān)鍵作用仍然是個未知數(shù)。IR-783 染料具有水溶性，易于在細(xì)胞膜上擴(kuò)散，并與宮頸癌細(xì)胞線粒體和溶酶體細(xì)胞器共定位，提示OATP 可能是宮頸癌細(xì)胞的主要途徑。的確，在宮頸癌細(xì)胞系中檢測到某些燕麥蛋白的差異表達(dá)。此外，CCK-8 和RIF 被用來證明OATP1B3和OATP1的轉(zhuǎn)運(yùn)功能是IR-783攝取的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，IR-783 作為一種七甲川碳花青素染料，為宮頸癌的高靈敏度檢測提供了一種有效的工具，并有望成為未來癌癥成像的新療法，但I(xiàn)R-783在宮頸癌細(xì)胞中具體的作用機(jī)制目前仍未明確，還有待進(jìn)一步研究。