李海麗，孫 艷，鄧靜敏△

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，南寧 530021；2.貴州省貴陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，貴陽(yáng) 550002）

支氣管哮喘（Asthma，簡(jiǎn)稱哮喘）是多基因遺傳的復(fù)雜疾病。到目前為止，已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道與哮喘發(fā)病相關(guān)的人類染色體區(qū)域及哮喘易感基因。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association studies，GWAS）是以單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphisms，SNP）為標(biāo)記、鑒定與復(fù)雜人類性狀和疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的遺傳變異、探究疾病遺傳機(jī)制的方法。GWAS 已鑒定出與數(shù)百種復(fù)雜疾病和特征相關(guān)的數(shù)千個(gè)基因座，并且在闡明這些關(guān)聯(lián)的因果變體和基因方面正在取得進(jìn)展[1]。其在哮喘遺傳機(jī)制研究中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。

GWAS 問(wèn)世前，連鎖分析方法最常被用于鑒定疾病的易感基因，而后隨著“人類基因組計(jì)劃”和“人類基因組單體型圖計(jì)劃”的完成以及基因分型技術(shù)的廣泛應(yīng)用，GWAS 已逐步取代傳統(tǒng)的遺傳學(xué)研究方法成為研究復(fù)雜遺傳性疾病的主流。GWAS 的優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需對(duì)特定基因預(yù)先進(jìn)行假設(shè)，且基因變異檢測(cè)效率高，其不便之處在于，它們需要大樣本量和用于處理大量數(shù)據(jù)的工具，在處理如此大量的數(shù)據(jù)過(guò)程中需要使用極其嚴(yán)格的檢驗(yàn)水準(zhǔn)以防止出現(xiàn)假陽(yáng)或假陰性結(jié)果。

哮喘GWAS 研究大部分為基于無(wú)關(guān)個(gè)體的關(guān)聯(lián)分析且多采用病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，部分研究采用基于家系的關(guān)聯(lián)研究。全球首個(gè)針對(duì)哮喘的GWAS 研究發(fā)現(xiàn)，17q12-q21 染色體上ORMDL3 基因rs7216389 位點(diǎn)與兒童哮喘存在強(qiáng)相關(guān)性，這一發(fā)現(xiàn)在歐洲獨(dú)立人群以及其他種族中也得到了一致的重復(fù)。因此，可以認(rèn)為17q21 號(hào)染色體是一個(gè)真正的哮喘易感性位點(diǎn)。迄今為止，全球范圍內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了許多關(guān)于哮喘的GWAS 研究，不同地域、種族、年齡、性別的易感基因及陽(yáng)性位點(diǎn)相繼被報(bào)道出來(lái)，現(xiàn)將近年來(lái)該領(lǐng)域的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)綜述如下。

1 哮喘GWAS 陽(yáng)性位點(diǎn)在基因中的分布概況

GWAS陽(yáng)性位點(diǎn)多位于基因編碼區(qū)。如17q12-q21 染色體上ORMDL3 基因rs12603332、rs4378650位點(diǎn)，GSDMB基因rs7216389位點(diǎn)等是位于基因編碼區(qū)中與哮喘相關(guān)的SNP陽(yáng)性位點(diǎn)。然而，越來(lái)越多的研究證實(shí)，GWAS 陽(yáng)性位點(diǎn)亦可出現(xiàn)在側(cè)翼序列、基因間等非編碼區(qū)。如AGT、DPP10、IKBKAP以及IL12RB1 等基因的編碼區(qū)與哮喘發(fā)病幾乎無(wú)關(guān)聯(lián)，而側(cè)翼非編碼區(qū)的罕見(jiàn)位點(diǎn)突變與非裔美國(guó)人群哮喘易感性顯著相關(guān)，其中IL12RB1基因側(cè)翼非編碼區(qū)的非同義突變與非、歐裔美國(guó)人群哮喘易感性均顯著相關(guān)。Th17 細(xì)胞系中IL-17A 基因間SNP rs1892280 和rs10807439 是過(guò)敏性鼻炎患者的保護(hù)或風(fēng)險(xiǎn)因素，白介素（IL）-17F 基因間SNP rs13192563是過(guò)敏性鼻炎合并哮喘患者的保護(hù)或風(fēng)險(xiǎn)因素。

2 目前哮喘易感基因GWAS 陽(yáng)性位點(diǎn)研究進(jìn)展

以“genome-wide association studies或GWAS或polymorphism”并“asthma”為條件在PubMed 外文數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與哮喘相關(guān)的GWAS 研究，共獲得2233 條結(jié)果，同時(shí)，以“全基因組關(guān)聯(lián)性分析或GWAS或基因多態(tài)性”并“哮喘”為篩選條件在中國(guó)知網(wǎng)上檢索相關(guān)研究共獲得504條結(jié)果，包括HLADRB1（6p21.32）、ORMDL3（17q12-q21）、ADAM33（20p13）、IL-13（5q31.1）等在內(nèi)的多個(gè)易感基因及SNP 位點(diǎn)相繼在不同人群中得到復(fù)制。筆者將從以下4個(gè)方面來(lái)闡述哮喘易感基因GWAS陽(yáng)性位點(diǎn)研究進(jìn)展。

2.1 高Th2型免疫通路相關(guān)基因

高Th2免疫通路涉及IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，其中IL-4 作為經(jīng)典的細(xì)胞因子在哮喘的發(fā)病中發(fā)揮著不可忽視的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在白人和非裔美國(guó)人中，IL-4基因啟動(dòng)子區(qū)的C-589T位點(diǎn)的T等位基因頻率存在顯著差異（分別為0.183 和0.544），且T等位基因的數(shù)量與FEV1值顯著負(fù)相關(guān)（P=0.035），結(jié)果表明，非裔美國(guó)人（47.2%受試者的FEV1＜50%的預(yù)測(cè)值））哮喘嚴(yán)重程度高于白人（36.4%受試者FEV1＜50%的預(yù)測(cè)值）。另有研究證實(shí)，IL-4R 基因突變位點(diǎn)Q576R 與I75V 共存時(shí)可上調(diào)IL-4R 的表達(dá)，增加IL-4R 對(duì)IL-4 的敏感性，加重氣道炎癥。而在對(duì)日本成年女性進(jìn)行的一項(xiàng)病例—對(duì)照研究顯示，IL-4 基因rs2243290 位點(diǎn)的AC 基因型可降低哮喘的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，是哮喘的一個(gè)保護(hù)因素[2]。

IL-33與生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白（ST2）結(jié)合可活化MAPKs 和NF-KB，并且誘導(dǎo)Th2 效應(yīng)細(xì)胞因子IL-13、IL-4、IL-5 等的釋放，在哮喘的Th2 型炎癥反應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，IL-33 與ST2 分別由IL-33基因、IL1RL1 基因編碼。Gudbjartsson 等[3]對(duì)9 392名冰島人血液DNA 進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)掃描，并對(duì)SNP 進(jìn)行分型，篩選出顯著差異的位點(diǎn)，并對(duì)這些位點(diǎn)在來(lái)自不同國(guó)家的人群（美國(guó)、瑞典、澳大利亞、德國(guó)、意大利、荷蘭、英國(guó)、韓國(guó)）中進(jìn)行復(fù)制，結(jié)果顯示，在這些人群中IL1RL1 上的rs1420101 為哮喘風(fēng)險(xiǎn)等位基因（P=5.3×10-14），且與血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。此外，該位點(diǎn)與IL1RL1上的另外兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs1921622、rs17026974在日本人群中均被證實(shí)與穩(wěn)定期成人哮喘呼出氣一氧化氮及嗜酸性粒細(xì)胞水平升高相關(guān)[4]。而針對(duì)4～8歲荷蘭兒童的GWAS 研究表明，IL1RL1 上的rs1420101僅與嗜酸性粒細(xì)胞水平升高相關(guān)[5]。另一項(xiàng)以歐洲人群為研究對(duì)象的GWAS 研究證實(shí)，IL1RL1 上另一個(gè)位點(diǎn)rs13408661 為哮喘相關(guān)陽(yáng)性位點(diǎn)（P=1.1×10-9)，而rs1420101（P=9.9×10-5）未能達(dá)到檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)（P＜5×10-8）[6]。rs928413 是在丹麥兒童病例—對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)的IL-33基因另一個(gè)哮喘陽(yáng)性位點(diǎn)，在中國(guó)人群中亦得到復(fù)制[7]，而在美洲印第安人群兒童（6～17 歲）中被證實(shí)與哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性[8]。綜上，不同種族人群、性別、年齡中同一個(gè)位點(diǎn)的重復(fù)結(jié)果不盡相同，因此對(duì)不同的人群進(jìn)行同一位點(diǎn)的驗(yàn)證十分必要。

IL-13 是IL-33 的下游因子，參與高Th2 型免疫通路介導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng)，不僅與嗜酸細(xì)胞等的募集、肥大細(xì)胞的活化有關(guān)還可以誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)、參與氣道重構(gòu)，是哮喘發(fā)病的重要炎癥因子。IL-13基因上的rs1295686 為哮喘風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)但與血清IgE水平無(wú)關(guān)聯(lián)，而該基因上的另一位點(diǎn)rs20541 則相反，僅與IgE 水平相關(guān)，與患哮喘風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)聯(lián)，可見(jiàn)同一基因上不同SNP 對(duì)表型的調(diào)控作用可能有所不同。隨后rs1295686和rs20541在亞洲和沙特阿拉伯人群中也得到復(fù)制，均被證實(shí)為哮喘發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)因素[9]。rs20541在芬蘭人群中也得到驗(yàn)證[10]。

胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）在由Th2 細(xì)胞介導(dǎo)的與哮喘相關(guān)的病理生理中起重要作用。早在2009年TSLP基因上的rs1837253 位點(diǎn)已被證實(shí)為哮喘和氣道高反應(yīng)性的保護(hù)因素。然而，針對(duì)日本人群進(jìn)行該位點(diǎn)的復(fù)制研究顯示，rs1837253 為哮喘患病的風(fēng)險(xiǎn)因素，同年，Torgerson 等[11]的研究也表明，rs1837253 為歐洲、西班牙、非洲這3 個(gè)人群的哮喘易感位點(diǎn)。此外，國(guó)內(nèi)的一項(xiàng)病例對(duì)照研究也證實(shí)了該位點(diǎn)是中國(guó)廣西壯族人群哮喘發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)因素。另一個(gè)位于TSLP 基因上與哮喘風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的陽(yáng)性位點(diǎn)為rs3806933，該位點(diǎn)可通過(guò)加強(qiáng)（AP）-1 與基因調(diào)控元件之間的連接以調(diào)控TSLP 基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)人支氣管上皮細(xì)胞中TSLP 對(duì)聚肌胞苷酸poly(I:C)的反應(yīng)，誘導(dǎo)過(guò)敏性炎癥的產(chǎn)生增加哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相關(guān)基因

HLA 基因具有高度多態(tài)性，其中HLA-II 類基因參與機(jī)體過(guò)敏反應(yīng)的抗原遞呈過(guò)程，其多態(tài)性與花粉、塵螨等特異性IgE 的產(chǎn)生相關(guān)。目前GWAS Catalog中與HLA基因相關(guān)的陽(yáng)性位點(diǎn)共111個(gè)，其中rs9500927（P=4×10-9）、rs9275698（P=5×10-12）、rs7775228（P=5×10-12）、rs3129890（P=5×10-13）4 個(gè)位點(diǎn)已被證實(shí)為日本人群的哮喘發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)因素，而rs9273349（P=7×10-14）是唯一在成人和兒童中都得到驗(yàn)證的位點(diǎn)[12]。此外，位于HLA-DPA1 和HLADPB1之間的SNP rs987870與日本和韓國(guó)兩個(gè)人群的小兒哮喘發(fā)病率升高密切相關(guān)[P（合并）=2.3×10-10]，而與屋塵螨特異性IgE 水平無(wú)關(guān)聯(lián)。rs9273373 是位于HLA 附近的另一個(gè)陽(yáng)性位點(diǎn)，對(duì)歐洲人群進(jìn)行的一項(xiàng)病例對(duì)照研究證實(shí)，該位點(diǎn)為哮喘合并過(guò)敏性鼻炎發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)因素，而與單個(gè)表型發(fā)病的相關(guān)性較低[13]。此外，位于HLA-DPB1基因上的rs1042151（Met105Val）位點(diǎn)在韓國(guó)人群中被證實(shí)與阿司匹林哮喘易感性相關(guān)性最高（P=5.11×10-7），并且該陽(yáng)性位點(diǎn)可上調(diào)HLA-DPB1的表達(dá)量，其與阿司匹林刺激后的FEV1 呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，為韓國(guó)人群阿司匹林哮喘的一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素[14]。

嗜乳脂蛋白樣-2（Butyrophilin-like 2，BTNL2）是近年發(fā)現(xiàn)的與B7 家族同源的分子，位于6p21 上HLA-Ⅱ和HLA-Ⅲ區(qū)域交界處，是一種T 細(xì)胞抑制分子，可向T細(xì)胞提供抑制信號(hào)，并在多種炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[15]。在日本人群中進(jìn)行的一項(xiàng)GWAS和復(fù)制研究，結(jié)果鑒定了幾個(gè)與成人哮喘易感性相關(guān)候選位點(diǎn)，其中3 個(gè)GWAS 陽(yáng)性突變位點(diǎn)rs404860（風(fēng)險(xiǎn)等位基因A）、rs3117098（風(fēng)險(xiǎn)等位基因G）和rs7775228（風(fēng)險(xiǎn)等位基因A），分別位于NOTCH4 基因、BTNL2 基因、HLA-DQA2 基因，均為炎癥相關(guān)基因。而國(guó)內(nèi)對(duì)廣西壯族人群進(jìn)行的復(fù)制研究?jī)H證實(shí)rs3117098 可能是中國(guó)壯族哮喘的危險(xiǎn)因素，未能重復(fù)GWAS確定的rs404860和rs7775228與壯族人群哮喘的關(guān)聯(lián)[16]。

2.3 將哮喘患者分層的GWAS研究

一項(xiàng)國(guó)際多中心GWAS 研究首次對(duì)哮喘患者進(jìn)行分層研究，該研究將患者按照不同特征分為兒童哮喘、遲發(fā)型哮喘、職業(yè)性哮喘和嚴(yán)重型哮喘亞組，并將不同亞組、血清IgE 水平以及GWAS 位點(diǎn)（分別位于IL1RL1/IL18R1、HLA-DQ、IL33、SMAD3、ORMDL3、GSDMB、GSDMA、IL2RB、SLC22A5、IL13、RORA 基因上或其附近）進(jìn)行相關(guān)性分析[17]。結(jié)果顯示，rs9273349、rs2284033 位點(diǎn)分別與兒童哮喘亞組、遲發(fā)型哮喘亞組以及兒童聯(lián)合遲發(fā)型哮喘亞組發(fā)病密切相關(guān)，是上述3 種表型發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，而rs3771166、rs1342326、rs744910、rs2305480、rs3894194 陽(yáng)性位點(diǎn)僅增加兒童聯(lián)合遲發(fā)型哮喘亞組的哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（P≤7.2×10-8），達(dá)GWAS 檢驗(yàn)水平。另外，剩余3 個(gè)位點(diǎn)rs2073643、rs1295686、rs11071559 雖被證實(shí)與哮喘易感性有關(guān)聯(lián)，但未達(dá)GWAS 檢驗(yàn)水平（P＜5×10-7）。該研究亦發(fā)現(xiàn)部分位點(diǎn)，如rs9271300，雖與哮喘發(fā)病無(wú)顯著性相關(guān)，但與患者血清IgE水平存在關(guān)聯(lián)，該位點(diǎn)在不同國(guó)家、民族均得到重復(fù)驗(yàn)證。此后，研究者們發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的與哮喘發(fā)病相關(guān)的新基因和新位點(diǎn)。我們的研究結(jié)果亦表明，TSLP 基因上rs1837253 位點(diǎn)、BTNL2基因上rs3117098位點(diǎn)屬于中國(guó)廣西壯族人群哮喘患病的危險(xiǎn)因素[11,16]，而ADAM33基因上S2（rs528557）位點(diǎn)屬于保護(hù)性因素，與降低壯族人群患哮喘風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[18]。

2.4 哮喘急性加重相關(guān)易感基因

盡管GWAS 已經(jīng)鑒定出了多個(gè)與哮喘發(fā)病相關(guān)的易感基因座，但目前對(duì)于哮喘急性發(fā)作的遺傳決定因素研究尚有限。2014 年，Bonnelykke 等[19]對(duì)丹麥哮喘兒童（2～6歲）進(jìn)行的一項(xiàng)GWAS研究證實(shí)CDHR3 是哮喘惡化的易感性基因。2015 年，Michael 等[20]對(duì)兩個(gè)非西班牙裔白人哮喘兒童隊(duì)列組合進(jìn)行的GWAS研究證實(shí)，CTNNA3基因內(nèi)含子區(qū)域中的rs7915695（P=2.19×10-8）、rs7923078（P=3.02×10-8）、rs7923279（P=3.34×10-8）和rs6480203（P=3.79×10-8）位點(diǎn)與哮喘急性加重顯著相關(guān)是致哮喘急性加重的高風(fēng)險(xiǎn)因素。2020 年，Yan 等[21]針對(duì)拉丁裔兒童和青少年進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃分析表明位于14q23.2 號(hào)染色體上 的FLJ22447 基因rs2253681 位點(diǎn)與重癥哮喘患者急性發(fā)作顯著相關(guān)（P=6.3×10-9），可顯著增加重癥哮喘惡化的概率。

3 GWAS 的局限性及展望

哮喘是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，是遺傳和環(huán)境因素交互作用的結(jié)果。關(guān)于哮喘的GWAS 研究涉及不同民族、性別、年齡，通過(guò)全基因組掃描，SNP分型已經(jīng)鑒定了大量的易感基因座及陽(yáng)性位點(diǎn)。然而，現(xiàn)有的GWAS研究大都專注于探索SNP位點(diǎn)與疾病易感性之間的相關(guān)性，而在某種程度上忽視了基因缺失、拷貝數(shù)變異、串聯(lián)重復(fù)序列等其他變異。此外，經(jīng)研究鑒定的陽(yáng)性SNP位點(diǎn)只能解釋疾病復(fù)雜遺傳性的小部分，其與疾病的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸不一定存在因果關(guān)系。最后，由于不同人群間等位基因頻率的差別以及連鎖不平衡導(dǎo)致了GWAS 結(jié)果的多樣性，同一個(gè)位點(diǎn)需要在不同的人群中重復(fù)，而樣本量少常導(dǎo)致重復(fù)率低或結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性。那么，對(duì)于陰性的GWAS結(jié)果是否有必要在不同的人群中進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證，檢驗(yàn)水準(zhǔn)應(yīng)該取多大范圍等這些問(wèn)題均值得我們進(jìn)一步探索。

盡管GWAS目前還存在一些局限性，但不可否認(rèn)的是它為探索哮喘遺傳學(xué)機(jī)制提供了一種新方法，經(jīng)GWAS驗(yàn)證得到的易感基因及SNP位點(diǎn)也為哮喘遺傳學(xué)機(jī)制的深入研究提供了新的檢測(cè)指標(biāo)。然而，這些檢測(cè)指標(biāo)的在哮喘診治和評(píng)估預(yù)后方面的有效性及安全性需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這將是未來(lái)GWAS領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。