蘭會華，曾江輝，黃雪梅

（1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院精準聯(lián)合檢驗中心，南寧 530021；2.廣西南寧市第二人民醫(yī)院檢驗科，南寧 530031；3.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院藥物臨床試驗機構辦公室，南寧 530021）

食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率高居第6位，死亡率居第7位，我國男性食管癌的預計發(fā)病例數(shù)占全球所有男性食管癌的53.6%[1]。目前食管癌臨床治療仍以手術、放療及化療等綜合治療為主，5年生存率不到10%[2]，該疾病的高死亡率是患者面臨的主要挑戰(zhàn)，如何提高治療效果是臨床工作的當務之急，隨著DNA測序和藥物基因組學等方面的研究進展，基于生物標志物檢測的個體化治療逐漸成為一種趨勢。

MicroRNAs(miRNAs)存在于真核生物中，是一類可調控基因表達的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，研究證實miRNAs在癌癥的發(fā)生、進展和治療中起著重要的作用，可作為多種腫瘤患者特異性生物標志物[3]。與食管癌相關的miRNAs 標志物研究逐年增多，本綜述基于大量文獻突出具有前瞻性的研究，根據(jù)食管癌中miRNA的表達差異與生存期的關系，分析其作為預后生物標志物和確定新的藥物靶點的潛力。

1 miRNAs 的基本生物學特性

miRNAs 是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，其長度約為22～24個核苷酸[4]。許多生理過程和疾病的發(fā)生發(fā)展，包括癌癥、心血管和代謝性疾病，都高度依賴于miRNAs 的調控。miRNAs 主要通過抑制信使RNA（mRNA）翻譯或促進mRNA降解，從而調控基因轉錄后水平的表達，多數(shù)miRNAs 以不完全互補方式與其靶向mRNA 的3’UTR 區(qū)（3’untranslated region）結合，從而阻礙對該mRNA的翻譯來調控基因表達，但不影響mRNA 的穩(wěn)定性。此外，還存在其他的調節(jié)機制，包括遺傳多態(tài)性、miRNA 啟動子的甲基化、不對稱miRNA鏈選擇、與RNA結合蛋白（RBPs）或其他編碼/非編碼RNA 的相互作用等，多種調節(jié)機制不僅調控它們的表達，還影響它們的活性和/或生物利用度[5]。

miRNA 通過作用于靶向mRNA 促使其降解或抑制其翻譯，從而調節(jié)原癌基因、癌基因或腫瘤抑制因子等靶基因的表達，如具有抑制癌基因功能的miRNA表達降低可導致癌基因的過表達，而具有抑制抑癌基因功能的miRNA 過表達可導致抑癌基因表達降低，致癌基因的過表達或抑癌基因表達降低均可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

2 食管癌中調控異常的miRNAs 及其有效靶點

食管癌主要有兩種類型：食管鱗狀細胞癌（ESCC）和腺癌（EAC），目前臨床上ESCC 占據(jù)95%，因此大量研究的主要組織學類型為ESCC。隨著DNA測序的發(fā)展，在過去的十年中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了成千上萬的miRNAs，而miRNA與其靶基因之間的互補性不完全，每個miRNA 可以靶向數(shù)百個靶基因，并且特定的基因可以被多個miRNA 靶向。當前面臨最具挑戰(zhàn)性的問題是miRNA靶標的識別和實驗驗證，在此，我們總結了在食管癌中調控異常并被驗證具備有效靶點的miRNAs，見表1。調控異常的miRNAs可下調或上調靶基因的表達水平，進而影響細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡來促進癌變，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)大量miRNAs 的表達發(fā)生了顯著的改變，其中一些miRNAs 通過抑制抑癌靶基因發(fā)揮致癌的作用，另一些miRNAs 通過下調致癌靶基因表現(xiàn)出腫瘤抑制特性。miRNAs通過各種途徑對腫瘤細胞的增殖與凋亡，生長與遷移等生物學行為進行調控，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移，從而影響腫瘤患者的預后。

表1 在食管癌中調控異常的miRNAs及其有效靶點

3 與食管癌預后相關的miRNAs

雖然與食管癌相關的miRNAs標志物研究逐年增多，但多處于基礎研究階段，本綜述基于大量文獻突出具有前瞻性的研究，根據(jù)食管癌中miRNA的表達差異與生存期的關系，分析該miRNA作為判斷食管癌預后標志物的效力。我們歸納總結了與食管癌預后相關的miRNAs 及其預后判斷指標，包括總生存期(overall Survival,OS)，無病生存期（disease free survival,DFS）或無進展生存期（progress Free Survival,PFS），采用多變量分析對比miRNA高表達組和低表達組的生存時間，用優(yōu)勢比（odds ratio,OR）、風險比值（hazard ratio,HR）、相對危險度（relative risk,RR）、95%置信區(qū)間（confidence interval,95%CI）和P值等進行描述，見表2。

表2 與食管癌預后相關的miRNAs

3.1 miRNAs作為食管癌的獨立預后因素

3.1.1 miR-146a的上調預示ESCC預后良好

miR-146a被證明能夠直接調控腫瘤的關鍵致癌靶點，如VEGF、Notch 或其他基因位點[16]。有研究采用侵襲實驗表明miR-146a-抑制劑可使食管癌細胞侵襲能力增加，在食管癌中miR-146a低表達會導致細胞增殖的增加和細胞凋亡的減少。分析miR-146a 在組織或血清樣本中的表達水平與臨床病理因素之間的關系，發(fā)現(xiàn)血清miR-146a水平具有較高的敏感性和特異性，可以作為ESCC 診斷的一種良好的非侵入性生物標志物。此外，通過比較腫瘤組織與正常組織中miR-146a 的表達差異及患者的生存時間，分析miR-146a在判斷食管癌患者預后中的價值，Kaplan-Meier 曲線顯示，其下調水平與OS 和PFS 呈負相關關系，進一步的單變量和多變量分析發(fā)現(xiàn)miR-146a 是ESCC 中OS 和PFS 的獨立預后因子，T期、N期和適當?shù)闹委熞才cOS或PFS有關[31]。

3.1.2 miR-655的上調預示ESCC預后良好 ZEB1和TGFBR2 是TGF-b 信號通路的重要組成部分，被認為是miR-655 的直接靶標，這表明通過對miR-655的異常下調激活TGF-b-ZEB1-e-cadherin軸可能會加速癌癥的進展。研究結果顯示，上皮細胞間質化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的抑制劑通過miR-655 靶向作用于ZEB1 和TGFBR2 可能是癌癥的預后良好的標志和治療有效的預兆[38]。Kiuchi 等[14]的研究同樣證實，在食管癌中miR-655 的表達水平與較好的預后有顯著的相關性，miR-655 表達水平低是淋巴轉移的獨立危險因素和預后較差的因素。

3.1.3 miR-625 的下調預示ESCC 預后不良 Li等[17]發(fā)現(xiàn)miR-625與食管癌的腫瘤深度、分期、轉移有關，通過qRT-PCR 檢測169 對ESCC 和癌旁組織的miR-625表達水平，發(fā)現(xiàn)在ESCC組織中miR-625的表達水平明顯低于癌旁組織；通過K-M生存曲線和log-rank 檢驗進行比較，發(fā)現(xiàn)miR-625 低表達的ESCC 患者總生存率低于miR-625 高表達的患者。低表達組5年總體生存率低于高表達組(P=0.001)，提示miR-625下調可能是預測ESCC患者腫瘤進展和預后不良的新型分子標記物。

3.1.4 miR-335 低表達提示ESCC 預后不良 研究顯示，ESCC標本中miR-335的表達明顯低于正常食管組織，miR-335的表達水平與組織學分級、淋巴結轉移、腫瘤分期、和臨床分期有顯著的相關性，miR-335 可作為一個獨立的預后因子，其高表達有利于患者生存。經(jīng)過5年的隨訪調查，結果顯示miR-335在ESCC 中下調與患者總生存期密切相關，在腫瘤組織中miR-335表達較低的患者的總體生存率比高表達的患者更差，證明了在ESCC 中miR-335 表達的減少可能與差的預后相關[18]。

3.1.5 miR-506 的上調提示ESCC 預后不良 miR-506 是腫瘤發(fā)生的重要調控因子，研究表明通過綁定目標mRNA，miR-506抑制靶基因的表達，參與調節(jié)和控制凋亡、周期阻滯、分化、EMT、細胞轉移以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的過程。Li 等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌中miR-506 高度表達，miR-506 可直接與細胞周期素依賴性激酶4/6(CDK 4/6)結合，然后與cyclinD 結合，刺激細胞周期從G1 期到S 期，此外，ets1蛋白是miR-506的重要靶點，ets1和miR-506的結合可能進一步影響食管癌血管生成，促進ESCC腫瘤細胞的生長、增殖和侵襲。根據(jù)ESCC 患者的長期隨訪顯示，與miR-506 低表達的ESCC 患者相比，miR-506高表達的患者生存率較低，多因素回歸分析顯示，miR-506的高表達是預測ESCC患者預后不良的重要獨立指標。

3.1.6 miR-16上調提示ESCC預后不良 Li等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-16 的過表達與細胞生長、遷移和侵襲、細胞周期調控的喪失以及細胞凋亡的減少有關，這一調控是通過下調靶基因基質金屬蛋白酶-9(MMP9)、維甲酸受體β2 (RAR-β2)和含有Kazal 基序的富含半胱氨酸的反轉錄蛋白(RECK)來實現(xiàn)的。此外，在ESCC 中，血漿中miR-16 的高表達與明顯減少的PFS 和OS 顯著相關。研究還發(fā)現(xiàn)，miR-16 的血漿水平不僅在早期檢測中表現(xiàn)出令人滿意的診斷性能，而且對于接受放射治療的ESCC患者來說，是一種有用的血液預后生物標志物[7]。

3.1.7 miR-191 上調預示ESCC 預后不良 有報道稱，MDM4作為一種癌蛋白，通過負調控P53的功能在P53抑癌通路中發(fā)揮關鍵作用，定位于MDM4 非翻譯區(qū)的rs4245739 A＞C多態(tài)性作用于miR-191靶位點，導致MDM4表達降低。為了研究這種多態(tài)性與患ESCC的風險及其在體內(nèi)的生物學功能之間的關系，用食道組織檢測基因多態(tài)性對MDM4表達的影響，對來自中國兩個地區(qū)的1 128例ESCC病例和1 150 例對照的兩組獨立病例-對照進行基因型測定，結果表明，MDM4 rs4245739 多態(tài)性有助于ESCC 的易感性，并支持了一種假設，即基因變異，中斷miRNA 介導的基因調控，可能會改變癌癥的風險[23]。另一研究表明，miR-191 可能通過綁定EGR1mRNA 的3’UTR 減少EGR1 表達參與ESCC的進展，作為轉錄因子，EGR1參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，并發(fā)揮抑癌作用，進一步研究證實EGR1下調促進了ESCC 細胞的生長和侵襲[35]。多變量Cox 回歸分析表明，miR-191在ESCC組織中過表達與晚期臨床分期、轉移和ESCC 存活率低有關，miR-191 的上調是ESCC患者生存率低的獨立預后因素。為了進一步探討miR-191在ESCC中的預后價值，采用Kaplan-Meier 分析和log-rank 檢驗觀察miR-191 與總生存率的關系，發(fā)現(xiàn)在食管癌中，miR-191高表達組較低表達組存活時間短，預后差。

3.2 miRNAs聯(lián)合檢測在食管癌預后評估中的作用

3.2.1 miR-21/miR-375 聯(lián)合檢測在食管癌預后評估中的作用 一項探討血漿miR-21 在ESCC 患者中的診斷價值的研究發(fā)現(xiàn)，miR-21是食管癌患者的獨立預后因素，可作為預測ESCC 放化療療效和3年生存率的有效生物標志物[33]。miR-21 上調提示食管鱗癌預后不良，使用miRNA-21 在化療的風險分層和預測總生存期方面具有重要的臨床意義[39]。此外，miR-21 過表達患者的復發(fā)概率也明顯高于miR-21 低表達患者，證明miR-21 作為監(jiān)測食管癌復發(fā)的敏感標志物的有效力[40]。

另一項研究[41]發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者的組織和血清樣本中，miR-21表達水平顯著升高，miR-375則下調，這兩種miRNAs的表達與浸潤深度、TNM分期、血管浸潤、淋巴結轉移都相關，表明miR-21和miR-375 在食管癌患者中均異常表達，是影響食管癌預后的獨立因素。進一步研究發(fā)現(xiàn)血漿中miR-21 高濃度組術后生存率明顯低于低濃度組，血漿miR-375 高表達組生存率優(yōu)于低表達組，血漿miR-21 高水平和miR-375低水平的患者預后明顯更差。ROC分析表明聯(lián)合檢測miR-21 和miR-375 的診斷價值高于miR-21或miR-375的單次檢測，聯(lián)合檢測可作為ESCC的診斷以及反映腫瘤的動態(tài)變化及預后效果的標志物。

3.2.2 miR-21/miR-93 聯(lián)合檢測在食管癌預后評估中的作用 最近的研究表明，miR-93-5p 可能通過PTEN/PI3K/Akt通路影響PTEN下游蛋白p21和cyclin D1 的表達，促進受體細胞增殖。miR-93-5p 在食管癌患者血漿中的表達是對照組的1.39倍，采用logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)血漿miR-93-5p表達上調顯著增加食管病變的風險，miR-93-5p 的過表達與不良的預后顯著相關，表明miR-93-5p 可作為食管癌診斷及預后判斷的生物標志物[42]。

Wang等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者的血清樣本中，miR-21和miR-93的表達水平顯著升高，兩者的表達均與患者的TNM 分期密切相關，miR-21 和miR-93在ESCC患者中高表達可能提示由于腫瘤的轉移而導致的更差的預后。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，放化療后miR-21 和miR-93 的表達明顯降低，提示觀察miR-21和miR-93的變化可用于預測患者放化療的療效。經(jīng)過對ESCC 患者進行3 年的追蹤回訪，發(fā)現(xiàn)其3年OS為37.50%，miR-21聯(lián)合miR-93檢測的AUC 用于評估ESCC 患者放化療的療效為0.894。Cox回歸分析顯示，患者高T期、N期、M期、高miR-21(＞5.60)和miR-93(＞3.87)的表達增加了死亡風險，患者miR-21和miR-93的高表達預示ESCC 患者治療無效的風險增加，表明miR-21 和miR-93聯(lián)合檢測可作為判斷ESCC患者預后的生物標志物。

4 結語

綜上所述，許多miRNAs 標志物與食管癌的預后密切相關，miRNAs 對于判斷食管癌預后生物標志物和確定新的藥物靶點可能具有巨大的潛在作用。相信通過進一步的臨床試驗，將有更多的食管癌預后相關的生物標志物用于指導臨床，為食管癌的治療及預后評估提供新的靶標，提高臨床療效，以期可實現(xiàn)真正的個體化治療。